WWW.NET.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Интернет ресурсы
 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

«ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО. ДИАГНОСТИКА И ПРОГНОЗ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Показатели по системе TNM, а также «классические» клиникоморфологические параметры имеют ограниченное прогностическое значение при НМКРЛ, в связи с чем, на сегодняшний день актуальным является поиск новых прогностических факторов. Такими факторами могут являться молекулярно-биологические маркеры - определяющие как прогноз, так и показания для последующего постоперационного лечения. Наиболее перспективным при НМКРЛ является изучение следующих молекулярно-биологических маркеров: Ag-ЯОР-белков, маркеров пролиферативной активности (Ki-67, топоизомеразы II), маркеров апоптоза (p53, bcl-2 и bax), маркеров ангиогенеза (CD34, подопланин) и мембранных рецепторов (статус белка и гена Her2). Однако, в мировой литературе исследования, посвященные изучению вышеперечисленных молекулярно-биологических маркеров при НМКРЛ, немногочисленны, а в отечественной литературе практически отсутствуют. В имеющихся литературных источниках приводятся противоречивые данные о взаимосвязи между вышеперечисленными молекулярно-биологическими маркерами, с одной стороны, и клинико-морфологическими параметрами, выживаемостью и прогнозом при НМКРЛ, с другой стороны. Отсутствуют исследования, в которых совокупно, комплексно изучались данные молекулярно-биологические маркеры и взаимосвязи между ними. Также отсутствуют исследования о взаимосвязи между коэкспрессией молекулярнобиологических маркеров и выживаемостью больных НМКРЛ. В то же время, в доступной литературе показаны противоречивые данные о наличии независимой прогностической значимости при НМКРЛ вышеперечисленных молекулярно-биологических маркеров.



ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

–  –  –

Исследование выполнено на операционном материале, полученном от 243 пациентов. Материал был получен в отделении торакальной онкологии Алтайского филиала РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН «Алтайский краевой онкологический диспансер» города Барнаула (директор - д.м.н., профессор, А.Ф. Лазарев). Набор материала осуществлялся с 1 августа 2007 года по 1 августа 2009 года. Исследование материала проведено на базе патологоанатомического отделения муниципального лечебно-профилактического учреждения "Когалымская городская больница" и лаборатории молекулярной диагностики Алтайского филиала РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН «Алтайский краевой онкологический диспансер» (заведующий - д.м.н., профессор, А.М.

Авдалян). Данные о выживаемости больных получены из «Канцер-регистра»

Алтайского края.

–  –  –

Средний возраст больных НМКРЛ составил 59,4±7,7 лет (от 35 до 75 лет), в 78% случаев в возрасте от 50 до 70 лет. В большинстве случаев больные были мужского пола - 209 (86%) случаев, женщины - 34 (14%) случая.

Не было отличий полового состава и гистологического типа опухоли от возраста больных. Среди больных женского пола преобладающим гистологическим типом была Ак (85%), среди мужчин – Пк (61%) (таблица 1).

В большинстве случаев (2/3 случаев) объем операции соответствовал лобэктомии, в остальных случаях (1/3 случаев) – пневмонэктомии. При Ак лобэктомия проводилась чаще по сравнению с плоскоклеточным раком, что связано с локализацией опухолевого узла (таблица 2).

–  –  –

Предоперационная химио-лучевая терапия не проводилась, постоперационная химио-лучевая терапия проведена 92 (38%) больным. При проведении химиотерапии в подавляющем большинстве случаев использовался цисплатин и этопозид. При лучевой терапии назначалась суммарная очаговая доза 50-60 Гр. Не было связи типа постоперационной химио-лучевой терапии с гистологическим типом НМКРЛ (таблица 3).





–  –  –

В исследование включены только случаи НМКРЛ – 111 случаев Ак и 132 случая Пк, случаев железисто-плоскоклеточного рака не было. Случаи с отдаленными метастазами (параметр М1) и первично-множественными опухолями исключены из исследования. Клинико-морфологические параметры и стадия заболевания определены согласно классификации TNM 7 пересмотра и представлена в таблице 4 и 5 [Sobin L., Gospodarowicz M., Wittekind C., 2009]. Показатель Т в 61% соответствовал Т2, в 27% - Т1 и в 12% - Т3, примерно с одинаковой частотой при Ак и Пк. Опухоли с показателем Т4 в исследовании отсутствовали. Опухоли с наибольшим размером 3 см незначительно преобладали над опухолями меньшего размера. В 36% отмечалось метастатическое поражение лимфатических узлов, с одинаковой частотой при Ак и Пк. Примерно в половине случаев определялась умеренная дифференцировка опухоли (таблица 4).

–  –  –

Высокая и низкая дифференцировка прослеживалась с примерно с одинаковой частой (в четверти случаев) – высокодифференцированные опухоли чаще наблюдались при Пк по сравнению с Ак, низкодифференцированные при Ак по сравнению с Пк. Первая стадия заболевания найдена в 57% случаев, вторая - в 25% и третья - в 18%. Распределение по стадии заболевания имело примерно одинаковую частоту при Ак и Пк (таблица 5).

В качестве контроля в 10 случаях исследованы кусочки патологически неизмененной ткани легкого – стенка бронха (бронхиальный эпителий) и паренхима легкого (альвеолярный эпителий), полученные из отдаленных от опухоли участков. Средний возраст составил 59 лет (от 45 до 75 лет), 5 женщин и 5 мужчин.

–  –  –

Для достижения цели исследования и решения поставленных задач в работе были применены следующие методы исследования:

1) гистологический

2) гистохимический

3) компьютерный анализ изображений

4) иммуногистохимический

5) SISH метод

6) статистическая обработка данных.

Гистологический метод. После операции материал немедленно доставлялся в патологогистологическую лабораторию, где производилось описание и вырезка. В протоколе гистологического исследования детально описывали макроскопическую картину: локализацию, характер роста, форму опухоли, измеряли наибольший размер опухоли, взаимоотношение с бронхиальным деревом, плеврой, распространенность некрозов и состояние региональных лимфатических узлов.

Из каждой опухоли забирали три кусочка:

один из центральной части и два из периферической части (из периферического отдела, который ближе к корню легкого и из противоположного периферического отдела, который ближе к плевре).

Кусочки ткани немедленно фиксировали в 10%-ном нейтральном, забуференном по Лилли (рН=7,4) растворе формалина в течение 18-24 часов.

Спиртовую проводку материала выполняли по стандартному протоколу в гистологическом аппарате LEICA TP 1020, заливку материала в парафин в аппарате LEICA EG 1160, срезы готовили на роторном микротоме LEICA RM

2135. Температура парафина при проводке и заливке не превышала 56С.

Приготовление красителей, буферных растворов и технику окраски проводили по общепринятым прописям, приведенным в соответствующих руководствах [Сапожников А.Г., Доросевич А.Е., 2000; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996; Автандилов Г.Г., 1994; Лилли Р., 1969; Пирс Э., 1962; Меркулов Г.А., 1961].

С парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4 мкм, которые помещали на предметное стекло и окрашивали растворами гематоксилина и эозина в автостейнере LEICA XL. Под световым микроскопом срезы исследовали для выявления общей морфологической картины, определения гистогенеза и степени гистологической дифференцировки опухоли.

Определение гистогенеза и степени гистологической дифференцировки опухоли [Краевский Н.А., Смольянников А.В., Саркисов Д.С., 1993; Головин Д.И., 1982; Tomashefski J.F., 2008; Syrigos K.N., Nutting C.M., Roussos C., 2006; Travis W.D. et al., 2004; Akcerman S., 1995]. При микроскопическом исследовании опухоли для Ак характерно наличие желестоподобных структур (ацинарных, папиллярных) и слизи (внутри- и/или внеклеточно). Для Пк характерно наличие межклеточных мостиков и кератина (внутри- и/или внеклеточно). Исходя из степени выраженности данных признаков выделяли три степени дифференцировки Ак или Пк - высокая, умеренная и низкая.

Рисунок 1. Ак: а – высокодифференцированная, б - умерено дифференцированная, в – низкодифференцированная, г – экспрессия цитокератина 7 при низкодифференцированной Ак, д – альциановый синий положительная (кислые мукополисахариды) и е – ШИК положительная (нейтральные мукополисахариды) секреция внутри- и внеклеточной слизи при умерено дифференцированной Ак.

а, б, в – окраска гематоксилином и эозином, г – иммуногистохимический метод, д, е – окраски ШИК реактивом и альциановым синим. х200.

Рисунок 2. Пк: а – высокодифференцированный, б - умерено дифференцированный, в – низкодифференцированный, г – экспрессия высокомолекулярного цитокератина (34E12) при умерено дифференцированном Пк, д – внутри- и внеклеточная секреция кератина при высокодифференцированном Пк, е – межклеточные мостики при высокодифференцированном Пк.

а, б, в – окраска гематоксилином и эозином, г – иммуногистохимический метод, д, е – окраски по Крейбергу. а, б, в, г, д - х200, е – х1000.

При высокодифференцированной Ак характерно наличие ацинарных и/или папиллярных структур и внутри- и/или внеклеточной слизи; при умерено дифференцированной Ак - ацинарные и/или папиллярные структуры менее развиты, определяются участки солидного строения, продукция внутри- и/или внеклеточной слизи снижена; при низкодифференцированной Ак характерно солидное строение, ацинарные и/или папиллярные структуры редуцированы по форме и редко встречаются, также редко определяются клетки с единичными каплями внеклеточной слизи (рисунок 1). В исследованном материале отсутствовали случаи бронхиолоальвеолярного рака и редких форм Ак (фетальной, муцинозной, перстневидно-клеточной и светлоклеточной).

При высокодифференцированном Пк характерно наличие развитых межклеточных мостиков, кератинизации цитоплазмы клеток (внутриклеточный кератин) и «роговых жемчужин» (внеклеточный кератин); при умерено дифференцированном Пк межклеточные мостики и кератинизации цитоплазмы клеток снижена, «роговые жемчужины» редуцированы по форме и редко встречаются; при низкодифференцированном Пк межклеточные мостики и кератинизации цитоплазмы встречаются в единичных клетках, «роговые жемчужины» не определяются (рисунок 2).

Для определения гистогенеза и степени дифференцировки опухоли, дополнительно к окраске гематоксилином и эозином, исследовались результаты гистохимической окраски срезов для выявления слизи (окраска ШИКреактивом и альциановым синим) и кератина (окраска по Крейбергу), а также результаты иммуногистохимического исследования. Для Ак характерным было положительное окрашивание на TTF-1, цитокератины 7/20 и отрицательное на кератин High Molecular Weight и 5/6; наоборот, для Пк - положительное окрашивание на кератин High Molecular Weight, 5/6 и отрицательное на TTF-1, цитокератины 7/20.

Изготовление тканевых матриц [van de Rijn M., Gilks C.B., 2004;

Packeisen J. et al., 2003; Bubendorf L. et al., 2001; Kononen J. et al., 1998]. В каждом случае из трех парафиновых блоков (блоков-доноров) забраны столбики ткани иглой-панчером с внутренним диаметром 1,5 мм, на основании просмотра соответствующих гистологических препаратов. Столбики ткани из парафиновых блоков-доноров помещены в шесть парафиновых блоковреципиентов, с формированием тканевых матриц 12х12 столбиков и размером 20х20 мм. С парафиновых блоков-реципиентов изготавливались серийные гистологические срезы толщиной 4 мкм и переносились на стекла (с двух парафиновых блоков на одно стекло) (рисунок 3).

Рисунок 3. Тканевые матрицы: справа – шесть блоков-реципиентов, по центру – три стекла окрашенные SISH методом (INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail), слева – три стекла окрашенные ИГХ методом с первичными антителами к TopoII.

Гистохимический метод. Срезы окрашивали ШИК-реактивом и альциановым синим, для выявление нейтральных и кислых мукополисахаридов, и по Крейбергу для выявления кератина, согласно общепринятым прописям.

Метод серебрения азотнокислым серебром Ag-ЯОР-белков проводили по одностадийной методике, согласно рекомендациям Ploton D. с соавторами (1986). Для данной методики использовались химически чистые стекла (после стандартной обработки в растворе хромпика), покрытые 0,1% раствором поли-L-лизина [Munakata S., Hendricks J.B., 1994]. На стекла монтировали срезы толщиной 4 мкм, приготовленные с парафиновых блоков, и высушивали при 37С на термостолике в течение 12 часов.

Протокол окрашивания [Trere D., 2000]:

1. Стандартная депарафинизация, дистиллированная вода.

2. Стекла со срезами помещали в термостойкий пластиковый стакан в 0,01 М раствор цитратного буфера (рН=6,0) и автоклавировали в автоклаве SIEMENS "VALIDATOR PLUS Model AE" при 120С в течение 20 минут.

После высокотемпературной обработки стекла со срезами охлаждали до комнатной температуры в бидистиллированной воде в течение 10 минут [Aubele M. et al., 1994].

3. На срезы наносили 2 капли 2%-го раствора желатины на 1% водном растворе муравьиной кислоты и 4 капли 50%-го водного раствора нитрата серебра. Для приготовления вышеуказанных растворов использовалась бидистилированная вода. Для окрашивания использовались только свежие растворы, приготовленные непосредственно перед окрашиванием. После нанесения растворов срезы покрывали покровным стеклом и помещали в термостат при 37С на 16 минут в герметично закрытой камере (чашка Петри), содержащей листок фильтровальной бумаги, смоченный дистиллированной водой [Trere D., 2000]. После инкубации стекла со срезами промывали в 2 сменах бидистиллированной воды по 3 минуты в каждой.

4. Докрашивания ядер не проводили, стандартно обезвоживали, заключали под покровное стекло в канадский бальзам.

Двойное окрашивание на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки.

Протокол окрашивания:

1. Стандартная депарафинизация, дистиллированная вода.

2. Для антигенного восстановления депарафинированные срезы обрабатывали в автоклаве SIEMENS "VALIDATOR PLUS Model AE" 20 минут при 120С в 0,01М цитратном буфере (рН=6,0); далее охлаждали 10 минут при комнатной температуре в дистиллированной воде.

3. Ингибирование эндогенной пероксидазы проводили в 3%-ном растворе перекиси водорода 20 минут при +4С. Промывание осуществляли в 2 сменах трис-буфера (рН=7,4) по 5 минут.

4. В качестве первичных антител использовались антитела к антигену Ki-67 (клон MIB-1, Dako) в разведении 1:400. Инкубацию с первичными антителами проводили 18-24 часа при +4С. Разведение первичных антител подобрано экспериментальным путем согласно времени окрашивания (минимальное фоновое окрашивание и максимальное специфическое). Для иммунного окрашивания использовали стрептавидин-биотиновый фосфатазный метод (LSAB2 System-АР, Dako). В качестве хромогенного субстрата для щелочной фосфатазы использовался Fuchsin (Dako). Стекла со срезами промывали в 2 сменах бидистилированной воды по 5 мин.

6. На срезы наносили 2 капли 2%-го раствора желатины на 1% водном растворе муравьиной кислоты и 4 капли 50%-го водного раствора нитрата серебра. Для приготовления вышеуказанных растворов использовалась бидистилированная вода. Для окрашивания использовались только свежие растворы, приготовленные непосредственно перед окрашиванием. После нанесения растворов срезы покрывали покровным стеклом и помещали в термостат при 37С на 18 минут в герметично закрытой камере (чашка Петри), содержащей листок фильтровальной бумаги, смоченный дистиллированной водой [Trere D., 2000]. После инкубации стекла со срезами промывали в 2 сменах бидистиллированной воды по 5 минуты в каждой.

7. Заключали под покровное стекло в водорастворимую среду Faramount Aqueous (Dako).

Компьютерный анализ изображений. Применяли следующее оборудование: микроскоп DMLS (Leica) проходящего света с подсоединенной цветной видеокамерой JVC TK-C1380E (Япония) и микроскоп CX41 (Olympus) проходящего света с подсоединенной цветной видеокамерой DP72 (Olympus). Изображение вводили в компьютер непосредственно с микроскопа с помощью видеокамеры. Каждое изображение сохраняли в формате TIFF или JPEG на жесткий диск компьютера, размер файла – 1360х1024 пикселей.

Программное обеспечение - анализатор изображений ImageJ 1.42.

Протокол полуавтоматизированного исследования площади (двойное окрашивание на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки) и ИП Ag-ЯОР-белков (окрашивание азотнокислым серебром на Ag-ЯОР-белки). Исследовали только ядра интерфазных клеток, с четкими очертаниями ядра (клетки в фазе митоза не учитывались), при увеличении микроскопа в 1000 раз (объектив х100, 1.25, oil, окуляр х10), с использованием иммерсионной системы. В каждом случае исследовались 100 ядер клеток, с 10-30 цифровых изображений, полученные с 10 полей зрения.

1. Вручную отмечали только ядра анализируемых эпителиальных клеток (с депозитами серебра в них), которые автоматически сохранялись на жесткий диск в стек (файл множественных изображений, размер каждого изображения по 125х125 пикселей, количество изображений 100) и переводились из цветного в серое изображение.

2. Калибровка программы. Для определения ИП Ag-ЯОР-белков предварительно измеряли площадь Ag-ЯОР-белков в 20-25 ядрах малых лимфоцитов, определяли среднюю площадь Ag-ЯОР-белков в ядрах малых лимфоцитов и проводили калибровку программы по средним значениям для каждого случая. ИП Ag-ЯОР-белков определяли как отношение площади Ag-ЯОРбелков в клетке к значению средней площади Ag-ЯОР-белков в ядре малого лимфоцита [Ruschoff J. et al., 1990]. Для исключения ошибки измерений в программе выставляли ограничение - гранулы размером менее 0,1 мкм исключены из анализа (не измерялись).

3. Анализ изображений: 1) автоматическое выделение гранул серебра в ядрах клеток по значению серого (0 – абсолютно черное, 256 – абсолютно белое) и перевод в бинарное изображение (0 – черное, 1 – белое). Во всех проведенных измерениях для выделения Ag-ЯОР-белков пороговое значение серого было установлено постоянным – 110. 2) автоматическoе измерение площади на бинарном изображении, с последующим расчетом ИП, среднего значения площади, среднего значения ИП и КВ Ag-ЯОР-белков. КВ Ag-ЯОРбелков определяли как отношение стандартного (среднеквадратического) отклонения к среднему значению и умноженное на 100%. Показатель пролиферации вычислялся как произведение ИМ Ki-67 на площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках.

4. Статистическая обработка полученных данных (результатов измерений и расчетов) произведена в программе STATISTICA.

Иммуногистохимический метод [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004].

Для данной методики использовались химически чистые стекла, после стандартной обработки в растворе хромпика, покрытые 0,1% раствором поли-Lлизина.

На стекла монтировали срезы толщиной 4 мкм, приготовленные с парафиновых блоков, и высушивали при 37С на термостолике в течение 12 часов. Все этапы ИГХ окрашивания проводились в автоматическом режиме в автостейнере BenchMark XT (Ventana). Использовались две группы первичных антител (таблица 6). Первая группа первичных антител – дифференциально-диагностические маркеры, характеризующие гистогенез опухоли. Вторая группа первичных антител - молекулярно-биологические маркеры, отражающие характеристики пролиферации, апоптоза, ангиогенеза, рецепторного статуса. Система визуализации ultraView Universal DAB Detection Kit (Ventana) – полимерный комплекс с вторичными антителами, хромоген DAB.

–  –  –

Критерии оценки экспресссии молекулярно-биологических маркеров проводили согласно общепринятым методикам и согласно протоколу производителя (таблица 7).

В каждом случае при исследовании Ki-67, TopoII, р53, Bcl-2, Bax вычисляли индекс метки (ИМ) для соответствующего антигена – количество положительно окрашенных клеток от общего числа исследованных клеток, выраженный в процентах.

–  –  –

В каждом случае при исследовании СD34 и Pod вычисляли соответственно плотность микроциркуляторного русла кровеносных сосудов (ПМЦР-Г) или лимфатических сосудов (ПМЦР-Л) - среднее значение количества сосудов в поле зрения с позитивно окрашенным эндотелием; подсчитывали отдельно расположенные сосуды с определяемым просветом и без просвета (кластеры позитивно окрашенных клеток). В каждом случае при исследовании Her2 оценку окрашивания проводили в баллах (от 0 до 3), согласно рекомендациям производителя, с модификацией предложенной для рака желудка [4], ввиду того, что НМКРЛ не является гормонозависимой опухолью, как рак молочной железы: 0 – нет окрашивания или мембранное окрашивание менее 10% клеток; 1+ - слабое или фрагментарное мембранное окрашивание более 10% клеток; 2+ - слабое или умеренное базолатеральное или полное мембранное окрашивание более 10% клеток; 3+ - умеренное или выраженное базолатеральное или полное окрашивание более 10% клеток.

SISH метод [Франк Г.А. и соавт., 2013; Завалишина Л.Э. и соавт., 2011]. Для данной методики использовались три стекла со срезами тканевых матриц. Все этапы подготовки срезов и непосредственно гибридизации in situ проводились в автоматическом режиме в автостейнере BenchMark XT (Ventana). Использовались: INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail - набор зондов меченных динитрофенилом (DNP) и дигоксигенином (DIG), для выявления соответственно гена Her2 и центромерного участка 17 хромосомы, ultra View Silver ISH DNP Detection – визуализирующая система на основе серебра (метка черного цвета) к зонду для гена Her2, меченного динитрофенилом (DNP), ultra View Red ISH DIG Detection - визуализирующая система на основе красителя Fast Red (метка красного цвета) к зонду для центромерного участка 17 хромосомы, меченного дигоксигенином (DIG).

Оценку результатов реакции SISH проводили согласно инструкции к набору: подсчитывали метку в 20/40 ядрах опухолевых клеток (увеличение х1000), вычисляли соотношение Her2/CEP17. Оценку амплификации проводили согласно рекомендациям производителя: при соотношении Her2/CEP171,8, считали, что амплификация гена Her2 отсутствует, а при соотношении Her2/CEP172,0 – наличие амплификации. При соотношении Her2/CEP17=1,8-2,0 в просчет включали дополнительный объем клеток до тех пор пока не получали пограничного уровня. Для оценки состояния CEP17 использовали классификацию, предложенную Wang S. с соавторами [21]: при наличии менее 2,25 красных меток - отсутствие увеличения CEP17, при наличии более 2,25 красных меток - увеличение CEP17. По состоянию гена Her2 и CEP17 выделены четыре типа опухоли: отсутствие амплификации гена Her2 и отсутствие увеличения CEP17 – тип N, отсутствие амплификации гена Her2 и наличие увеличения CEP17 – тип P, наличие амплификации гена Her2 и отсутствие увеличения CEP17 – тип A, наличие амплификации гена Her2 и наличие увеличения CEP17 – тип AP.

Статистическая обработка данных. Статистические расчеты проводили автоматизированно в статистическом пакете прикладных программ STATISTICA, версия 6.0 (Stat-Soft Inc., USA, 2001) [Боровиков В.П., 2003, 2000, 1998; Боровиков В.П., Ивченко Г.И., 2000; Реброва О.Ю., 2002; Халафян А.А., 2007; Вуколов Э.А., 2004; Автандилов Г.Г., 2002]. В полученных выборках предварительно определяли характер распределения данных, с помощью теста Колмогорова-Смирнова и по критерию Шапиро-Уилка (W), на основании которых выбирали методы описания и анализа. Представление данных в выборках и методы анализа выбраны следующие.

1. Описательная статистика. В каждой выборке определяли четыре статистических момента: первый статистический момент - центральная тенденция (среднее или медиана); второй статистический момент – мера рассеяния (стандартное отклонение или интерквартильный интервал), также дополнительно определяли минимальное и максимальное значения выборки; третий статистический момент - ассиметрия; четвертый статистический момент – эксцесс. При параметрическом распределении меру центральной тенденции в группах представляли в виде среднего (М), меру рассеяния в виде стандартного отклонения (с.о.). При непараметрическом распределении меру центральной тенденции в группах представляли в виде медианы (Ме), меру рассеяния в виде интерквартильного интервала (и.и.) – интервал между 25 % и 75 % данных в выборке, который независимо от распределения данных в выборке представляет 50% данных вокруг центральной тенденции.

2. Различия между величинами оценивали непараметрическими методами. При сравнении качественных и порядковых (полуколичественных) данных - двусторонний точный критерий Фишера. При сравнении количественных данных – предварительно, для избежания проблемы множественных сравнений, в выборках данные сравнивали с использованием однофакторного теста Краскелла-Уоллиса (аналог параметрического дисперсионного анализа), затем выборки попарно сравнивали с использованием U-критерия Манна-Уитни.

3. Степень корреляции оценивали с использованием непараметрических методов: при сравнении качественных и порядковых (полуколичественных) данных – тест 2, при сравнении количественных данных - рангового коэффициента корреляции Спирмена (r). Силу корреляции оценивали как слабая при r0,25, умеренная 0,25r0,75, сильная r0,75.

Выживаемость больных рассчитывали актуариальных способом. Общую 5-летнюю выживаемость определяли с даты операции до даты последнего наблюдения или смерти от любой причины. Для анализа выживаемости использовали метод Каплана - Мейера, для сравнения между группами - тест log-rank. Для выявления значимости влияния отдельного фактора или совокупности факторов на выживаемость больных использовали непараметрический вариант регрессионного анализа - модель пропорциональных интенсивностей Кокса. Достоверность оценивали при р0,05 - 95% уровень безошибочного суждения.

Таким образом, для достижения цели исследования и решения поставленных задач исследование выполнено на достаточном объеме материала (выборки), были использованы современные методические и методологические подходы исследования, выбраны корректные методы статистического анализа результатов исследования.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 3. Ag-ЯОР-БЕЛКИ

При окраске азотнокислым серебром Ag-ЯОР-белки имели вид гранул черного цвета, матрикс ядрышек окрашивался в коричневый или темнокоричневый цвет, ядра клеток окрашивались в светло-желтый цвет. В эпителиальных клетках гранулы серебра черного цвета располагались либо на коричневом фоне ядрышка (внутриядрышковая локализация Ag-ЯОР-белков), либо на светло-желтом фоне ядра (внеядрышковая локализация Ag-ЯОРбелков). В ядрах малых лимфоцитов (фолликулы лимфатического узла) определялись от 1 до 2 гранул серебра (чаще одно), по размерам соответствовавшие ядрышкам, матрикс ядрышка не окрашивался (рисунок 4в). Средняя площадь Ag-ЯОР-белков в ядре малого лимфоцита равнялась 1,48 (0,12) мкм2, КВ Ag-ЯОР-белков 19,7 (1,1) %.

Рисунок 4. Ag-ЯОР-белки в ядрах клеток неизмененного эпителия альвеол (а), бронха (б) и в малых лимфоцитах фолликулов лимфатического узла (в) стромы.

Окраска азотнокислым серебром, х1000.

В ядрах клеток неизмененного эпителия альвеолы определялись от 1 до 2 гранул серебра, по размерам соответствовавшие ядрышкам, матрикс ядрышка не окрашивался. В ядрах клеток неизмененного эпителия бронха определялись 1-3 (чаще два) ядрышка, округлой формы, небольших размеров, с 1-3 гранулами серебра (рисунок 4а,б). Морфология Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток неизмененного эпителия альвеол аналогична таковой в ядрах малых лимфоцитов лимфатических фолликулов, в фибробластах и в гладкомышечных клетках стромы. В ядрах клеток неизмененного эпителия альвеол ИП Ag-ЯОР-белков составил 1,31±0,20, КВ Ag-ЯОР-белков 28,3±3,1%. В эпителии бронхов ИП Ag-ЯОР-белков составил 1,85±0,24, КВ Ag-ЯОРбелков 29,3±3,3 %. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое увеличение ИП и КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р0,001). Размер ядрышек в раковых клетках был значительно больше по сравнению с клетками неизмененного эпителия, с характерным полиморфизмом ядрышек умеренной и выраженной степени. Для ядер раковых клеток была характерна как внутриядрышковая, так и значительная внеядрышковая локализация гранул серебра, а также разные размеры гранул серебра.

Ag-ЯОР-белки исследованы в 243 НМКРЛ, из них 111 Ак и 132 Пк.

3.1. ИП Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параллели

В НМКРЛ ИП Ag-ЯОР-белков составил 6,52±1,66; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,99, р=0,96). Минимальное значение выборки составило 2,25, максимальное – 11,80. Гистограмма распределения характеризовалась незначительными сдвигом вправо (ассиметрия 0,13) и островершинностью (эксцесс 0,03) (рисунок 5а).

Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 8 и 9. Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским.

Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с ИП Ag-ЯОР-белков. Пол больных НМКРЛ и Ак имел слабую корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (соответственно r=0,20 и r=0,24, р0,05).

Рисунок 5. Гистограммы распределения ИП Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в).

По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах).

–  –  –

Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 10. ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше в группе Т2-3 по сравнению с Т1. Также при размере первичной опухоли более 3 см ИП Ag-ЯОР-белков был больше, чем в опухоли менее 3 см. ИП Ag-ЯОР-белков имел умеренную корреляцию

–  –  –

Рисунок 6. Ag-ЯОР-белки при Ак: а, б – опухоль с показателем Т1 и Т2 соответственно, в, г – опухоль с наибольшим размером до 3 см и более 3 см соответственно, д, е – опухоль с показателем N0 и N1 соответственно.

Окраска азотнокислым серебром, х1000.

с показателем Т (r=0,34, р0,001) и размером первичной опухоли (r=0,45, р0,001). Таким образом, с увеличением размера опухолевого узла наблюдалось увеличение количественных показателей ядрышковых организаторов в клетках опухоли, что указывало на повышение пролиферативной активности в процессе роста опухоли в больших по размеру опухолях.

Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов. Показатель N при НМКРЛ имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р0,001). Таким образом, метастатический потенциал НМКРЛ был связан с высокими количественными показателями ядрышковых организаторов опухолевых клеток.

ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше при II и III стадии по сравнению с I стадией. Стадия процесса при НМКРЛ имела умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р0,001). Таким образом, на ранних этапах опухолевого роста количественные показатели Ag-ЯОР-белков минимальны по сравнению с последующими стадиями процесса.

ИП Ag-ЯОР-белков достоверно больше в Пк по сравнению с Ак. Гистогенез НМКРЛ имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,36, р0,001) (рисунок 8). Таким образом, имелась зависимость количественных показателей Ag-ЯОР-белков от тканевого происхождения опухоли.

В клетках НМКРЛ ИП Ag-ЯОР-белков больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой (рисунок 8). Степень дифференцировки НМКРЛ имела умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,33, р0,001). Количественные показатели ядрышковых организаторов возрастали в зависимости от степени дедифференцировки НМКРЛ.

Тест Краскела-Уоллиса показал статистически значимые отличия ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ в группах показатель Т, наибольший размер опухоли, показатель N, стадия заболевания, гистогенез и дифференцировка.

В Ак ИП Ag-ЯОР-белков составил 6,05±1,78; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,99, р=0,58). Минимальное значение выборки составило 2,25, максимальное – 10,63. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,17) и незначительной пологостью вершины (эксцесс -0,41) (рисунок 5б). В клетках Ак наблюдалось статистически значимое повышение ИП Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным альвеолярным эпителием (р0,001).

Рисунок 7. Ag-ЯОР-белки при Пк: а, б – опухоль с показателем Т1 и Т2 соответственно, в, г – опухоль с наибольшим размером до 3 см и более 3 см соответственно, д, е – опухоль с показателем N0 и N1 соответственно.

Окраска азотнокислым серебром, х1000.

Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 11.

Таблица 11. ИП Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параметры Ак.

–  –  –

Отмечалось последовательное увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Ак в группах Т1, Т2 и Т3, однако, статистически значимое отличие найдено только между группами Т1 и Т2, Т3 (рисунок 6а,б). Показатель Т имел тенденцию к слабой корреляции с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,27, р=0,006).

В Ак с размером первичной опухоли менее 3 см ИП Ag-ЯОР-белков был меньше, чем в опухоли более 3 см (р0,001) (рисунок 6в,г). Размер Ак имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,42, р0,001).

Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Ак с наличием метастатического поражения лимфатических узлов по сравнению с опухолью без метастазов (р0,01) (рисунок 6д,е). Отсутствовали статистически значимые отличия ИП Ag-ЯОР-белков между N1, N2 и N3. Показатель N в Ак имел тенденцию к слабой корреляции с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,22, р=0,03).

Рисунок 8. Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ с разной степенью дифференцировки: а, в, д – соответственно высоко-, умерено и низкодифференцированная аденокарцинома, б, г, е – соответственно высоко-, умерено и низкодифференцированный плоскоклеточный рак.

Окраска азотнокислым серебром, х1000.

Отмечается последовательное увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Ак в I, II, III стадии заболевания, однако, статистически значимое отличие получено только между I и II, I и III стадиями. Стадия заболевания Ак имела тенденцию к слабой корреляции с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,23, р=0,02).

ИП Ag-ЯОР-белков был статистически значимо ниже в клетках высокодифференцированной Ак по сравнению с умерено и низкодифференцированной и имел умеренную (r=0,33, р0,001) корреляцию.

Проведенный тест Краскела-Уоллиса показал статистически значимые отличия ИП Ag-ЯОР-белков в Ак в группах показатель Т, наибольший размер опухоли, показатель N и дифференцировка.

–  –  –

В Пк ИП Ag-ЯОР-белков составил 6,96±1,46; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,98, р=0,1). Минимальное значение выборки составило 4,10, максимальное – 11,80. Гистограмма распределения характеризовалась умеренным сдвигом вправо (ассиметрия 0,52) и незначительной островершинностью (эксцесс 0,29) (рисунок 5в). В клетках Пк наблюдалось статистически значимое повышение ИП Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием бронхов (р0,001). Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток Пк во взаимосвязи с клиникоморфологическими параметрами представлены в таблице 12.

Отмечалось статистически значимое последовательное увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Пк в группах Т1, Т2 и Т3 (рисунок 7а,б). Показатель Т имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,35, р=0,02). В клетках Пк с размером первичной опухоли менее 3 см ИП Ag-ЯОР-белков был меньше, чем в опухоли более 3 см (р=0,002) (рисунок 7в,г). Размер Пк имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,37, р=0,002).

Найдено статистически значимое увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Пк с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (р0,01) (рисунок 7д,е). Отсутствовали отличия ИП Ag-ЯОР-белков между N1, N2 и N3. Показатель N при Пк имел умеренную корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,36, р=0,003).

Отмечалось последовательное увеличение ИП Ag-ЯОР-белков в Пк при I, II, III стадиях заболевания; однако, статистически значимое отличие получено только между I и II, I и III стадиями. Стадия заболевания Пк умеренно коррелировала с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,37, р=0,003).

ИП Ag-ЯОР-белков статистически значимо увеличивался в ряду высоко-, умерено и низкодифференцированный Пк. ИП Ag-ЯОР-белков имел умеренную корреляцию со степенью дифференцировки (r=0,35, р0,001).

Проведенный тест Краскела-Уоллиса показал статистически значимые отличия ИП Ag-ЯОР-белков в Пк в группах показатель Т, наибольший размер опухоли, показатель N, стадия заболевания и дифференцировка.

3.2. ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры

Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 13. Так как при НМКРЛ среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,52, то случаи с ИП AgЯОР-белков 6,52 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (118 случаев – 49%), до 6,52 мкм – с небольшим (125 случаев – 51%).

Таблица 13. ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ.

–  –  –

В НМКРЛ при увеличении количественных показателей ИП Ag-ЯОРбелков отмечалось увеличение количественных показателей КВ Ag-ЯОРбелков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. Также в группе опухолей с большим количественным значением ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось большее количество р53 положительных случаев, меньшее количество bcl-2 положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При НМКРЛ ИП Ag-ЯОР-белков имел корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,43, р0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,71, р0,001), ПП (r=0,43, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,34, р0,001), ИМ ТороII (r=0,32, р0,001), экспрессией р53 (r=0,24, р0,01), bcl-2 (r=-0,22, р0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,14, р0,05).

Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Ак во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 14. Так как при Ак среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,05, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,05 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (48 случаев – 43%), до 6,05 мкм – с небольшим (63 случая – 57%).

–  –  –

В Ак при увеличении количественных показателей ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось увеличение количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков, AgЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. Также в группе опухолей с большим количественным значением ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось большее количество р53 положительных случаев, меньшее количество bcl-2 положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При Ак ИП Ag-ЯОР-белков имел корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,46, р0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,76, р0,001), ПП (r=0,48, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,37, р0,001), ИМ ТороII (r=0,35, р0,001), экспрессией р53 (r=0,29, р0,01), bcl-2 (r=-0,27, р0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,24, р0,01). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИП Ag-ЯОРбелков с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ.

Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 15. Так как при Пк среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,96, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,96 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (59 случаев – 45%), до 6,96 мкм – с небольшим (73 случая – 55%).

–  –  –

В Пк при увеличении количественных показателей ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось увеличение количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков, AgЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. Также в группе опухолей с большим количественным значением ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось большее количество р53 положительных случаев и меньшее количество bcl-2 положительных случаев. При Пк ИП Ag-ЯОР-белков имел корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,48, р0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,74, р0,001), ПП (r=0,46, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,39, р0,001), ИМ ТороII (r=0,36, р0,001), экспрессией р53 (r=0,33, р=0,002) и bcl-2 (r=-0,31, р0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИП Ag-ЯОР-белков с молекулярнобиологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением амплификации гена Her2 – взаимосвязь с которой отсутствовала при Пк.

3.3. КВ Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параллели

В НМКРЛ КВ Ag-ЯОР-белков составил 30,5±4,6%; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,99, р=0,42). Минимальное значение выборки составило 17,1, максимальное – 43,3. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,02) и незначительной островершинностью (эксцесс 0,02) (рисунок 9а). В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое повышение КВ AgЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р0,01). Увеличение вариабельности Ag-ЯОР-белков в клетках опухоли по сравнению с неизмененной тканью подтверждало факт участия ядрышкового аппарата клетки в процессе канцерогенеза.

Рисунок 9. Гистограммы распределения КВ Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в).

По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах).

Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 8 и 9. Найдено статистически значимое увеличение КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны.

Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с КВ AgЯОР-белков. Пол больных НМКРЛ и Ак имел слабую корреляцию с КВ AgЯОР-белков (r=0,22 и r=0,28, р0,001).

Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 16.

Таблица 16. КВ Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параметры НМКРЛ.

–  –  –

КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше в группе Т2-3 по сравнению с Т1. Также при размере первичной опухоли более 3 см КВ AgЯОР-белков был больше, чем в опухоли менее 3 см (рисунок 10 а,б). КВ AgЯОР-белков имел умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,29, р=0,006) и размером первичной опухоли (r=0,34, р0,001). Таким образом, с увеличением размера опухолевого узла наблюдалось увеличение гетерогенности ядрышковых организаторов в клетках опухоли, что указывало на неоднородность пролиферативной активности в больших по размеру опухолях.

Не найдено статистически значимого увеличения КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 1). Показатель N при НМКРЛ не имел корреляции с КВ Ag-ЯОР-белков. Таким образом, метастатический потенциал НМКРЛ не связан с гетерогенностью ядрышковых организаторов опухолевых клеток.

КВ Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ не имел достоверных отличий при II и III стадии по сравнению с I стадией. Стадия процесса при НМКРЛ не имела корреляции с КВ Ag-ЯОР-белков. Таким образом, на ранних и поздних этапах опухолевого роста гетерогенность Ag-ЯОР-белков одинакова.

КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше в Пк по сравнению с Ак (рисунок 10 в,г). Гистогенез НМКРЛ имел умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,29, р=0,01). Таким образом, имелась зависимость гетерогенности Ag-ЯОР-белков от тканевого происхождения опухоли.

В клетках НМКРЛ КВ Ag-ЯОР-белков больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой (рисунок 10 д,е). Степень дифференцировки НМКРЛ имела умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,27, р=0,02). Гетерогенность ядрышковых организаторов возрастали в зависимости от степени дедифференцировки НМКРЛ.

Проведенный тест Краскела-Уоллиса показал статистически значимые отличия ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ в группах показатель Т, наибольший размер опухоли, гистогенез и дифференцировка.

В Ак КВ Ag-ЯОР-белков составил 29,8±4,7%; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,98, р=0,03). Минимальное значение выборки составило 17,1, максимальное – 40,7. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом влево (ассиметрия 0,03) и незначительной пологостью вершины (эксцесс -0,18) (рисунок 9б).

Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 17. В клетках Ак наблюдалось статистически значимое повышение КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным альвеолярным эпителием (р0,01).

КВ Ag-ЯОР-белков ниже в группе опухолей Т1 по сравнению с Т2 и Т3, но статистическая значимость отличий была найдена только между группами Т1 и Т2. Между показателем Т и КВ Ag-ЯОР-белков отсутствовала корреляция.

Рисунок 10. Гетерогенность Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ: а, б – опухоль с наибольшим размером до 3 см и более 3 см соответственно, в, г – соответственно при Ак и Пк, д, е – соответственно при высокой и низкой дифференцировке.

Окраска азотнокислым серебром, х1000.

Таблица 17. КВ Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параметры Ак.

–  –  –

В Ак с размером первичной опухоли менее 3 см КВ Ag-ЯОР-белков был меньше, чем в опухоли более 3 см (р=0,002). Размер Ак имел умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,35, р0,001). Отсутствовали статистически значимые отличия КВ Ag-ЯОР-белков между N0, N1, N2 и N3. Показатель N в Ак не имел корреляции с КВ Ag-ЯОР-белков. КВ Ag-ЯОР-белков приблизительно одинаков в группах I, II и III стадия и не имел статистически значимых отличий. Стадия заболевания Ак не коррелировала с КВ Ag-ЯОРбелков. КВ Ag-ЯОР-белков был статистически значимо ниже в клетках высокодифференцированной Ак по сравнению с умерено и низкодифференцированной и имели незначительную корреляцию (r=0,20, р=0,03). Тест КраскелаУоллиса показал статистически значимые отличия КВ Ag-ЯОР-белков в Ак только в группе наибольший размер опухоли.

В Пк КВ Ag-ЯОР-белков составил 31,2±4,4%; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,99, р=0,5). Минимальное значение выборки составило 21,2, максимальное – 43,3. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,14) и значительной островершинностью (эксцесс 0,14) (рисунок 9в). В клетках Пк наблюдалось статистически значимое повышение КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием бронхов (р0,01).

Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Пк во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 18.

Таблица 18. КВ Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параметры Пк.

–  –  –

Отмечалось последовательное увеличение КВ Ag-ЯОР-белков в Пк в группах Т1, Т2 и Т3. Однако статистически значимого отличия между этими группами не найдено. Показатель Т не имел корреляции с КВ Ag-ЯОРбелков. В клетках Пк с размером первичной опухоли менее 3 см КВ Ag-ЯОРбелков был меньше, чем в опухоли более 3 см (р=0,04) (рисунок 1 б). Размер Пк не имел корреляции с КВ Ag-ЯОР-белков. Найдено статистически значимое увеличение КВ Ag-ЯОР-белков в Пк с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (р=0,01) (рисунок 1 в). Отсутствовали статистически значимые отличия КВ Ag-ЯОРбелков между N1, N2 и N3. Показатель N при Пк имел умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,31, р=0,01). При разных стадиях Пк КВ AgЯОР-белков не имел статистически значимых отличий. Стадия заболевания Пк не коррелировала с КВ Ag-ЯОР-белков. КВ Ag-ЯОР-белков последовательно увеличивался в ряду высоко-, умерено и низкодифференцированный Пк, но статистическая значимость получена только для низкодифференцированного рака. КВ Ag-ЯОР-белков не имел корреляции со степенью дифференцировки опухоли. Проведенный тест Краскела-Уоллиса показал статистически значимые отличия КВ Ag-ЯОР-белков в Пк только в группе показатель N.

3.4. КВ Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры

Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 19. Так как при НМКРЛ среднее значение КВ Ag-ЯОР-белков составило 30,5, то случаи с КВ AgЯОР-белков 30,5 и более считались с большим КВ Ag-ЯОР-белков (108 случай – 44%), до 30,5 мкм – с небольшим (135 случаев – 56%).

В НМКРЛ при увеличении количественных показателей КВ Ag-ЯОРбелков отмечалось увеличение количественных показателей ИП Ag-ЯОРбелков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. При НМКРЛ КВ Ag-ЯОР-белков имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,43, р0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,39, р0,001), ПП (r=0,36, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,35, р0,001), ИМ ТороII (r=0,26, р0,001).

Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Ак во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 20. Так как при Ак среднее значение КВ Ag-ЯОР-белков составило 29,8, то случаи с КВ Ag-ЯОР-белков 29,8 и более считались с большим КВ Ag-ЯОР-белков (54 случая – 49%), до 29,8 мкм – с небольшим (57 случаев – 51%).

–  –  –

В Ак при увеличении количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков отмечалось увеличение количественных показателей ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. При Ак КВ Ag-ЯОРбелков имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,46, р0,001), Ag-ЯОРбелками (MIB-1) (r=0,45, р0,001), ПП (r=0,39, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,41, р0,001), ИМ ТороII (r=0,31, р0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи КВ Ag-ЯОР-белков с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ.

Таблица 21. КВ Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры Пк.

–  –  –

Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 21. Так как при Пк среднее значение КВ Ag-ЯОР-белков составило 31,2, то случаи с КВ Ag-ЯОР-белков 31,2 и более считались с большим КВ Ag-ЯОР-белков (62 случай – 47%), до 31,2 мкм – с небольшим (70 случаев – 53%).

В Пк при увеличении количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков отмечалось увеличение количественных показателей ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. При Пк КВ Ag-ЯОРбелков имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,48, р0,001), Ag-ЯОРбелками (MIB-1) (r=0,41, р0,001), ПП (r=0,41, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,39, р0,001), ИМ ТороII (r=0,29, р0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи КВ Ag-ЯОР-белков с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ.

Суммируя данные результатов исследования ИП и КВ Ag-ЯОР-белков следует отметить следующие основные моменты.

В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое повышение ИП и КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Имеется гендерная взаимосвязь с ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, так как найдено статистически значимое увеличение ИП и КВ Ag-ЯОР-белков у лиц мужского пола по сравнению с женским. ИП и КВ Ag-ЯОР-белков были взаимосвязаны с основными клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: показателем Т, наибольшим размером опухоли, гистогенезом и дифференцировкой. Также ИП и КВ Ag-ЯОР-белков имели корреляцию с большинством молекулярнобиологических маркеров: Ag-ЯОР-белками (MIB-1), показателем пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороII, экспрессией р53, bcl-2 и состоянием гена Her2.

Таким образом, исследование ИП и КВ Ag-ЯОР-белков является важной молекулярно-биологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования.

ГЛАВА 4. Ag-ЯОР-БЕЛКИ В MIB-1 ПОЗИТИВНЫХ КЛЕТКАХ

Результат иммуногистохимического окрашивания срезов с первичными антителами MIB-1 и последующей окраской азотнокислым серебром определялся в виде округлых гранул черного цвета (Ag-ЯОР-белки), расположенных на фоне красного ядра (в MIB-1 позитивных клетках) или на фоне коричневого ядрышка или бледно-желтого ядра (в MIB-1 негативных клетках) (рисунок 11). В неизмененном эпителии бронха Ag-ЯОР-белки (MIB-1) составила 2,19±0,27 мкм, ПП 8,8±1,1. В неизмененном эпителии альвеолы MIB-1 позитивные клетки отсутствовали. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП по сравнению с неизмененным эпителием бронхов (р0,001). Ag-ЯОР-белки (MIBисследована в 207 НМКРЛ, из них 94 Ак и 113 Пк.

Рисунок 11. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках неизмененного эпителия бронха. Двойная окраска на Ki-67 (клон MIB-1) методом иммуногистохимии и на Ag-ЯОР-белки азотнокислым серебром, х1000.

–  –  –

В НМКРЛ Ag-ЯОР-белки (MIB-1) составила 10,47 (8,57-12,69) мкм;

распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,98, р=0,02). Минимальное значение выборки составило 4,89 мкм, максимальное

– 18,25 мкм. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,26) и незначительной пологостью вершины (эксцесс -0,56) (рисунок 12а).

Рисунок 12. Гистограммы распределения Ag-ЯОР-белков (MIB-1) при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y относительное содержание (в процентах).

Результаты определения Ag-ЯОР-белков (MIB-1) при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 22 и 23. Отсутствовала статистически значимая взаимосвязь пола и возраста больных НМКРЛ, Ак и Пк с Ag-ЯОР-белками (MIB-1).

Результаты определения Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 24.

Отмечалось увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) в группе Т2-3 по сравнению с Т1. При размере первичной опухоли менее 3 см Ag-ЯОР-белки (MIB-1) была меньше, чем в опухоли более 3 см. Найдено увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) НМКРЛ с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 1 а, б). Ag-ЯОР-белки (MIB-1) меньше в I стадию заболевания по сравнению с II-III стадиями. Отсутствовало отличие Ag-ЯОР-белков (MIB-1) между Ак и Пк (рисунок 15). Ag-ЯОР-белки (MIB-1) больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой (рисунок 15). В НМКРЛ Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела корреляцию с показателем Т (r=0,36, р0,001), наибольшим размером опухоли (r=0,44, р0,001), показателем N (r=0,39, р0,001), стадией заболевания (r=0,35, р0,001) и дифференцировкой (r=0,33, р0,001).

–  –  –

Рисунок 13. Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках при Ак: а, б – опухоль с показателем Т1 и Т2 соответственно, в, г – опухоль с наибольшим размером до 3 см и более 3 см соответственно, д, е – опухоль с показателем N0 и N1 соответственно.

Двойная окраска на Ki-67 (клон MIB-1) методом иммуногистохимии и на AgЯОР-белки азотнокислым серебром, х1000.

–  –  –

Результаты определения Ag-ЯОР-белков (MIB-1) Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 25. В Ак Ag-ЯОР-белки (MIB-1) составила 10,56±2,96 мкм; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,98, р=0,2). Минимальное значение выборки составило 4,89 мкм, максимальное – 18,25 мкм. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,2) и незначительной пологостью вершины (эксцесс -0,45) (рисунок 12б).

Отмечалось последовательное увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) в группах Т1, Т2 и Т3, однако, статистически значимое отличие найдено только между группами Т1 и Т2, Т3 (рисунок 13а,б). При размере первичной опухоли менее 3 см Ag-ЯОР-белки (MIB-1) была меньше, чем в опухоли более 3 см (рисунок 13в,г). Найдено статистически значимое увеличение Ag-ЯОРбелков (MIB-1) в Ак с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 13д,е). Ag-ЯОРбелки (MIB-1) достоверно больше при 2 и 3 стадии по сравнению с 1 стадией, Рисунок 14. Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках при Пк: а, б – опухоль с показателем Т1 и Т2 соответственно, в, г – опухоль с наибольшим размером до 3 см и более 3 см соответственно, д, е – опухоль с показателем N0 и N1 соответственно.

Двойная окраска на Ki-67 (клон MIB-1) методом иммуногистохимии и на AgЯОР-белки азотнокислым серебром, х1000.

а также при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокой (рисунок 1 а, б). В Ак Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,40, р0,001), наибольшим размером опухоли (r=0,46, р0,001), показателем N (r=0,35, р0,001), стадией процесса (r=0,33, р=0,001) и дифференцировкой (r=0,36, р0,001).

–  –  –

В Пк Ag-ЯОР-белки (MIB-1) составила 10,67±2,78 мкм; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,98, р=0,1). Минимальное значение выборки составило 5,61 мкм, максимальное – 17,66 мкм. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,25) и значительной пологостью вершины (эксцесс -0,65) (рисунок 12в). Результаты определения Ag-ЯОР-белков (MIB-1) Пк во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 26.

Отмечалось последовательное увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) в группах Т1, Т2 и Т3, однако, статистически значимое отличие найдено только для Т3 по сравнению с Т1 и Т2 (рисунок 14а,б).

Рисунок 15. Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках при НМКРЛ с разной степенью дифференцировки: а, в, д – соответственно высоко-, умерено и низкодифференцированная аденокарцинома, б, г, е – соответственно высоко-, умерено и низкодифференцированный плоскоклеточный рак.

Двойная окраска на Ki-67 (клон MIB-1) методом иммуногистохимии и на AgЯОР-белки азотнокислым серебром, х1000.

–  –  –

При размере первичной опухоли менее 3 см Ag-ЯОР-белки (MIB-1) была меньше, чем в опухоли более 3 см (рисунок 14в,г). Найдено статистически значимое увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) в Пк с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 14д,е). Ag-ЯОР-белки (MIB-1) последовательно возрастает в 1, 2 и 3 стадию заболевания, однако, достоверное отличие найдено между 3 стадией и 1, 2 стадиями; между 1 и 2 стадиями – на уровне тенденции статистической значимости. Также последовательное увеличение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) прослеживается при снижении дифференцировки опухоли, статистически значимое отличие найдено при высокодифференцированной карциноме по сравнению с умерено и низкодифференцированной (рисунок 1 а, б).

В Пк Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,33, р0,001), наибольшим размером опухоли (r=0,35, р0,001), показателем N (r=0,34, р0,001), стадией процесса (r=0,34, р0,001) и дифференцировкой (r=0,25, р0,01).

–  –  –

Результаты определения Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 27.

–  –  –

Так как при НМКРЛ медиана Ag-ЯОР-белков (MIB-1) составила 10,47 мкм, то случаи с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) 10,47 мкм и более считались с большой площадью (101 случай – 49%), до 10,47 мкм – с небольшой (106 случаев – 51%). В НМКРЛ при увеличении Ag-ЯОР-белков (MIB-1) отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. Также в группе опухолей с большой Ag-ЯОРбелками (MIB-1) отмечалось большее количество р53-положительных случаев, меньшее количество bcl-2 положительных случаев и большее количество случаев с положительным ИГХ Her2 статусом. При НМКРЛ Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,71, р0,001), КВ AgЯОР-белков (r=0,39, р0,001), показателем пролиферации (r=0,49, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,27, р0,001), ИМ ТороII (r=0,26, р0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,20, р0,05), bcl-2 отрицательной экспрессией (r=-0,22, р0,01) и ИГХ Her2 статусом (r=0,17, р0,05).

Результаты определения Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках Ак во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 28. Так как при Ак среднее значение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) составило 10,56 мкм, то случаи с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) 10,56 мкм и более считались с большой площадью (44 случая – 47%), до 10,56 мкм – с небольшой (50 случаев – 53%).

–  –  –

В Ак при увеличении Ag-ЯОР-белков (MIB-1) отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. При Ак Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела корреляцию с ИП Ag-ЯОРбелков (r=0,76, р0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,45, р0,001), показателем пролиферации (r=0,52, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,31, р0,001), ИМ ТороII (r=0,32, р0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи Ag-ЯОРбелков (MIB-1) с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ, за исключением экспрессии р53, bcl-2 и ИГХ Her2 статуса – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Ак.

Результаты определения Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 29. Так как при Пк среднее значение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) составило 10,67 мкм, то случаи с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) 10,67 мкм и более считались с большой площадью (57 случаев – 50%), до 10,67 мкм – с небольшой (56 случаев

– 50%).

–  –  –

В Пк при увеличении Ag-ЯОР-белков (MIB-1) отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков и ПП. Также в группе опухолей с большой Ag-ЯОР-белками (MIB-1) отмечалось меньшее количество bcl-2 положительных случаев и большее количество случаев с положительным ИГХ Her2 статусом. При Пк Ag-ЯОР-белки (MIB-1) имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,74, р0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,41, р0,001), показателем пролиферации (r=0,55, р0,001), bcl-2 отрицательной экспрессией (r=-0,26, р0,05) и ИГХ Her2 статусом (r=0,21, р0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи Ag-ЯОР-белков (MIB-1) с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением ИМ Ki-67, ИМ ТороII и экспрессии р53 – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк.

4.3. Показатель пролиферации и клинико-морфологические параллели

В НМКРЛ ПП составил 304,2 (172,9-476,5); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,92, р0,001). Минимальное значение выборки составило 11,6, максимальное – 1245,7. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,07) и значительной островершинностью (эксцесс 0,97) (рисунок 16а).

Рисунок 16. Гистограммы распределения ПП при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах).

Результаты определения ПП при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 22 и 23. Найдено статистически значимое увеличение ПП при НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с показателем пролиферации. Пол больных НМКРЛ и Ак имел умеренную корреляцию с показателем пролиферации (соответственно r=0,32 и r=0,42, р0,001).

Результаты определения ПП при НМКРЛ во взаимосвязи с клиникоморфологическими параметрами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 30.

–  –  –

Отмечалось увеличение ПП в группе Т2-3 по сравнению с Т1. При размере первичной опухоли менее 3 см ПП был меньше, чем в опухоли более 3 см. Найдено увеличение ПП при НМКРЛ с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 1 а, б). ПП был меньше в I стадию заболевания по сравнению с II-III стадиями, а также при Ак по сравнению с Пк. ПП был больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой (рисунок 1 в, г). В НМКРЛ ПП имел корреляцию с показателем Т (r=0,29, р=0,006), наибольшим размером опухоли (r=0,39, р0,001), показателем N (r=0,30, р=0,003), стадией заболевания (r=0,33, р0,001), гистогенезом (r=0,37, р0,001) и дифференцировкой (r=0,37, р0,001).

В Ак ПП составил 218,4 (80,3-454,1) ; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,89, р0,001). Минимальное значение выборки составило 11,6, максимальное – 1245,7. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,19) и значительной островершинностью (эксцесс 1,55) (рисунок 16б). Результаты определения ПП при Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 31.

–  –  –

Отмечалось последовательное увеличение ПП в группах Т1, Т2, Т3 и при I, II, III стадиях заболевания, однако, отличия статистически не значимые. При размере первичной опухоли менее 3 см ПП была меньше, чем в опухоли более 3 см. Найдено статистически значимое увеличение ПП в Ак с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 1 в, г). ПП достоверно больше при высокодифференцированной Ак по сравнению с умерено и низкодифференцированной (рисунок 1 а, б). В Ак ПП имел умеренную корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,31, р=0,002), дифференцировкой (r=0,45, р0,001) и слабую корреляцию с показателем N (r=0,23, р=0,048).

–  –  –

В Пк ПП составил 343,3 (222,0-558,4); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,89, р0,001). Минимальное значение выборки составило 83,3, максимальное – 1178,6. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,15) и значительной островершинностью (эксцесс 0,85) (рисунок 16в). Результаты определения ПП Пк во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 32.

Отмечалось последовательное увеличение ПП в группах Т1, Т2 и Т3, однако, статистически значимое отличие найдено только для Т3 по сравнению с Т1 и Т2. При размере первичной опухоли менее 3 см ПП был меньше, чем в опухоли более 3 см. Найдено статистически значимое увеличение ПП в Пк с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 1 в, г). ПП последовательно увеличивался в I, II и III стадию заболевания, однако, достоверное отличие найдено только для I стадии. Последовательное увеличение ПП найдено при снижении дифференцировки опухоли (рисунок 1 а, б). В Пк ПП имел умеренную корреляцию с показателем Т (r=0,35, р0,001), наибольшим размером опухоли (r=0,25, р=0,01), стадией процесса (r=0,32, р0,001), дифференцировкой (r=0,31, р0,01) и слабую корреляцию с показателем N (r=0,23, р=0,02).

4.4. Показатель пролиферации и молекулярно-биологические маркеры

Результаты определения ПП при НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 33. Так как при НМКРЛ медиана ПП составила 456,3, то случаи с показателем пролиферации 456,3 и более считались с большим показателем пролиферации (100 случаев – 50%), до 456,3 – с небольшим (100 случаев – 50%).

–  –  –

В НМКРЛ при увеличении ПП отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. Также в группе опухолей с большим показателем пролиферации отмечалось большее количество р53 и bax положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При НМКРЛ ПП имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,43, р0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,36, р0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,49, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,74, р0,001), ИМ ТороII (r=0,52, р0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,25, р0,001), bax положительной экспрессией экспрессией (r=0,20, р0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,21, р0,01).

Результаты определения ПП при Ак во взаимосвязи с молекулярнобиологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 34. Так как при Ак медиана ПП составила 327,6, то случаи с показателем пролиферации 327,6 и более считались с большим показателем пролиферации (46 случаев – 51%), до 327,6 – с небольшим (45 случаев – 49%).

–  –  –

В Ак при увеличении ПП отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. Также в группе опухолей с большим показателем пролиферации отмечалось большее количество р53 положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При Ак ПП имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,48, р0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,39, р0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,52, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,77, р0,001), ИМ ТороII (r=0,57, р0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,28, р0,05) и амплификацией гена Her2 (r=0,26, р0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ПП с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ, за исключением экспрессии bax – взаимосвязь с которой отсутствовала при Ак.

Результаты определения ПП при Пк во взаимосвязи с молекулярнобиологическими маркерами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 35. Так как при Пк медиана ПП составила 514,9, то случаи с показателем пролиферации 514,9 и более считались с большим показателем пролиферации (55 случаев – 50%), до 514,9 – с небольшим (54 случая – 50%).

–  –  –

В Пк при увеличении ПП отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. Также в группе опухолей с большим показателем пролиферации отмечалось большее количество р53 положительных случаев и меньшее количество bcl-2 положительных случаев. При Пк ПП имел корреляцию с ИП AgЯОР-белков (r=0,46, р0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,41, р0,001), Ag-ЯОРбелками (MIB-1) (r=0,55, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,79, р0,001), ИМ ТороII (r=0,29, р0,05), р53 положительной экспрессией (r=0,23, р0,05), bcl-2 отрицательной экспрессией (r=-0,24, р0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ПП с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением экспрессии bax и амплификации гена Her2 – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк. Однако, при Пк по сравнению с НМКРЛ отмечается корреляция ПП с экспрессией bcl-2.

Суммируя данные результатов исследования Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП следует отметить следующие основные моменты. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое повышение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Имеется гендерная взаимосвязь с показателем пролиферации, так как найдено статистически значимое увеличения ПП у лиц мужского пола по сравнению с женским. AgЯОР-белки (MIB-1) и ПП были взаимосвязаны с основными клиникоморфологическими параметрами по системе TNM: показателем Т, наибольшим размером опухоли, показателем N, стадией процесса, гистогенезом и дифференцировкой. Также Ag-ЯОР-белки (MIB-1) и ПП имели корреляцию с большинством молекулярно-биологических маркеров: ИП и КВ Ag-ЯОРбелков, ИМ Ki-67, ИМ ТороII, экспрессией р53, bcl-2, bax, ИГХ Her2 статусом и амплификацией гена Her2. Таким образом, исследование Ag-ЯОРбелков (MIB-1) и ПП является важной молекулярно-биологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования.

ГЛАВА 5. МАРКЕРЫ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

При проведении иммуногистохимического окрашивания на антиген Kiи ТороII окрашивались ядра эпителиальных клеток и ядра пролиферирующих клеток лимфатических фолликулов, воспалительного инфильтрата стромы от светло- до темно-коричневого цвета.

Рисунок 17. Экспрессия Ki-67 (а) и ТороII (б) в неизмененном эпителии бронхов. Иммуногистохимический метод, х400.

По выраженности (интенсивности) окрашивания эпителиальных клеток на антиген Ki-67 можно было выделить три типа ядер интерфазных клеток: гранулярный, гранулярно-диффузный и диффузный [Lindboe C.F., Torp S.H., 2002]. Гранулярный тип окрашивания – соответствовал незначительной интенсивности окрашивания ядер клеток - характеризовался отсутствием или незначительным окрашиванием ядра (нуклеоплазмы), на фоне которой четко выделялись интенсивно прокрашенные ядрышки в виде гранул. Гранулярнодиффузный тип окрашивания – соответствовал умеренной интенсивности окрашивания ядер клеток - характеризовался умеренным окрашиванием нуклеоплазмы (более интенсивным по сравнению с гранулярным типом), на фоне которой определялась гранулярность (более интенсивно окрашенные ядрышки). Диффузный тип окрашивания – соответствовал выраженной интенсивности окрашивания ядер клеток - характеризовался равномерным, интенсивным окрашиванием ядра, ядрышки не дифференцировались. Разная интенсивность окрашивания ядер интерфазных клеток (ядрышек и нуклеоплазмы) зависит от фазы клеточного цикла и последовательного изменения локализации антигена Ki-67 в ядре на протяжении клеточного цикла. В фазе митоза также определяется окрашивание хромосом делящихся ядер - интенсивного, равномерного типа, причем форма окрашивания полностью соответствует морфологической форме митоза или патологического митоза (рис.

21). При определении ИМ Ki-67 окрашенные хромосомы в М-фазе не подсчитывались. Окрашивание на антиген ТороII имело интенсивный, равномерный, диффузный характер окрашивания ядра, ядрышки не дифференцировались.

В неизмененном эпителии альвеол ИМ Ki-67 и ТороII составил менее 1% (единичные положительные клетки). В неизмененном эпителии бронхов ИМ Ki-67 составил 4 (1-8)%, ИМ ТороII - менее 1% (единичные положительные клетки). Ki-67 и ТороII позитивные клетки определялись в базальном слое и нижней трети эпителия бронха. В НМКРЛ наблюдалось повышение ИМ Ki-67 и ИМ ТороII по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р0,001) (рисунок 17).

Экспрессия антигена Ki-67 исследована в 215 НМКРЛ, из них 97 Ак и 118 Пк. Экспрессия антигена ТороII исследована в 193 НМКРЛ, из них 82 Ак и 111 Пк.

5.1. Ki-67 и клинико-морфологические параллели

В НМКРЛ ИМ Ki-67 составил 25 (18-42)% ; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,93, р0,001). Минимальное значение выборки составило 2%, максимальное – 95%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,93) и значительной островершинностью (эксцесс 0,62) (рисунок 18а).

Результаты определения ИМ Ki-67 при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 36 и 37. Найдено статистически значимое увеличение ИМ Ki-67 в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с ИМ Ki-67. Пол больных НМКРЛ и Ак имел умеренную корреляцию с ИМ Ki-67 (соответственно r=0,37 и r=0,42, р0,001).

Рисунок 18. Гистограммы распределения ИМ Ki-67 при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах).

–  –  –

Результаты определения ИМ Ki-67 при НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 38. Отмечалось увеличение ИМ Ki-67 в группах Т2-3 по сравнению с Т1 (показатель Т), N1-3 по сравнению с N0 (показатель N), II-III по сравнению с I (стадия заболевания), однако, статистически значимого отличия не было получено.

–  –  –

Рисунок 19. Экспрессия Ki-67 при Ак с разным наибольшим размером новообразования (а, в, д – 3 см; б, г, е - 3 см) и разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома).

Иммуногистохимический метод, х400.

Статистически значимые отличия ИМ Ki-67 получены в следующих группах: наибольший размер опухоли (до 3 см и более 3 см), гистогенез (Ак и Пк), дифференцировка (высокодифференцированная и умерено, низкодифференцированная опухоль) (рисунок 19, 20). ИМ Ki-67 при НМКРЛ имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,21, р0,01), дифференцировкой (r=0,22, р0,01) и умеренную корреляцию с гистогенезом (r=0,31, р0,001). Таким образом, пролиферативная активность увеличивается в процессе увеличения размера НМКРЛ и при Пк по сравнению с Ак. В опухолях без солидизации (высокодифференцированные) по сравнению с опухолями с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференцированные) минимально содержание антигена Ki-67.

–  –  –

В Ак ИМ Ki-67 составил 20 (11-38)%; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,92, р0,001). Минимальное значение выборки составило 2%, максимальное – 92%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,93) и умеренной островершинностью (эксцесс 0,49) (рисунок 18б). Результаты определения ИМ Ki-67 в Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 39.

Рисунок 20. Экспрессия Ki-67 при Пк с разным показателем Т (а, в, д – Т1-2;

б, г, е – Т3) и разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома).

Иммуногистохимический метод, х400.

Отмечалось последовательное увеличение ИМ Ki-67 в Ак в группах Т1, Т2, Т3 (показатель Т), N0, N1, N2 (показатель N), I, II, III (стадия заболевания), однако, достоверного отличия не было получено. Статистически значимые отличия ИМ Ki-67 получены в следующих группах: наибольший размер опухоли (до 3 см и более 3 см), дифференцировка (высокая и умеренаянизкая) (рисунок 19). ИМ Ki-67 в Ак имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,25, р=0,02), дифференцировкой (r=0,23, р=0,03). Таким образом, пролиферативная активность увеличивается в процессе увеличения размера Ак. Также в опухоли без солидизации (высокодифференцированная) по сравнению с опухолью с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференцированная) минимально значение ИМ Ki-67.

Таблица 40. ИМ Ki-67 и клинико-морфологические параметры при Пк.

–  –  –

В Пк ИМ Ki-67 составил 30 (23-45)%; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,89, р0,001). Минимальное значение выборки составило 11%, максимальное – 95%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,17) и значительной островершинностью (эксцесс 0,83) (рисунок 18в). Результаты определения ИМ Ki-67 в эпителиальных клетках Пк в связи с клиникоморфологическими параметрами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 40.

Отмечалось последовательное увеличение ИМ Ki-67 в Пк в группах Т1, Т2, Т3, однако, статистически значимое отличие получено только между Т3 и Т1, Т2. ИМ Ki-67 возрастал в группах опухолей до 3 см и более 3 см (наибольший размер), N0, N1, N2, N3 (показатель N), I, II и III стадии заболевания; однако, статистически значимого отличия не было получено. Достоверное отличие ИМ Ki-67 получено в ряду высоко-, умерено и низкодифференцированный Пк (рисунок 20). ИМ Ki-67 в Пк имел слабую корреляцию с показателем Т (r=0,24, р=0,008) и умеренную корреляцию с дифференцировкой (r=0,33, р р0,001).

<

5.2. Ki-67 и молекулярно-биологические маркеры

Результаты определения ИМ Ki-67 при НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 41. Так как при НМКРЛ медиана ИМ Ki-67 составила 25%, то случаи с ИМ Ki-67 25% и более считались с большим ИМ Ki-67 (116 случаев – 54%), до 25% – с небольшим (99 случаев – 46%).

В НМКРЛ при увеличении ИМ Ki-67 отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП и ИМ ТороII. Также в группе опухолей с большим ИМ Ki-67 отмечалось большее количество р53 и bax положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При НМКРЛ ИМ Ki-67 имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,34, р0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,35, р0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,27, р0,001), ПП (r=0,74, р0,001), ИМ ТороII (r=0,68, р0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,22, р0,01), bax положительной экспрессией (r=0,23, р0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,16, р0,05).

–  –  –

Результаты определения ИМ Ki-67 при Ак во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 42. Так как при Ак медиана ИМ Ki-67 составила 20%, то случаи с ИМ Ki-67 20% и более считались с большим ИМ Ki-67 (51 случай – 53%), до 20% – с небольшим (46 случаев – 47%).

–  –  –

В Ак при увеличении ИМ Ki-67 отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП и ИМ ТороII. Также в группе опухолей с большим ИМ Ki-67 отмечалось большее количество р53 положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При Ак ИМ Ki-67 имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,37, р0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,41, р0,001), AgЯОР-белками (MIB-1) (r=0,31, р0,001), ПП (r=0,77, р0,001), ИМ ТороII (r=0,71, р0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,28, р0,001) и амплификацией гена Her2 (r=0,21, р0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИМ Ki-67 с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ, за исключением экспрессии bax – взаимосвязь с которой отсутствовала при Ак.

Результаты определения ИМ Ki-67 при Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 43. Так как при Пк медиана ИМ Ki-67 составила 30%, то случаи с ИМ Ki-67 30% и более считались с большим ИМ Ki-67 (65 случаев – 55%), до 30% – с небольшим (53 случая – 45%).

–  –  –

В Пк при увеличении ИМ Ki-67 отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ПП и ИМ ТороII. При Пк ИМ Ki-67 имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,39, р0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,39, р0,001), ПП (r=0,79, р0,001), ИМ ТороII (r=0,73, р0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИМ с молекулярноKi-67 биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением Ag-ЯОР-белков (MIB-1), экспрессии р53, bax и амплификации гена Her2 – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк.

5.3 Топоизомераза II и клинико-морфологические параллели

В НМКРЛ ИМ ТороII составил 19 (12-27)%; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,91, р0,001). Минимальное значение выборки составило 1%, максимальное – 80%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,26) и значительной островершинностью (эксцесс 2,41) (рисунок 21а).

Рисунок 21. Гистограммы распределения ИМ ТороII при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах).

Результаты определения ИМ ТороII при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 36 и 37. Найдено статистически значимое увеличение ИМ ТороII в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с ИМ ТороII. Пол больных НМКРЛ и Ак имел умеренную корреляцию с ИМ ТороII (соответственно r=0,32 и r=0,38, р0,001).

–  –  –

Результаты определения ИМ ТороII в НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 44. Отмечалось увеличение ИМ ТороII в группах Т2-3 по сравнению с Т1 (показатель Т), N1-3 по сравнению с N0 (показатель N), IIIII по сравнению с I (стадия заболевания), однако, статистически значимого отличия не было получено. Статистически значимые отличия ИМ ТороII получены в следующих группах: наибольший размер опухоли (до 3 см и Рисунок 22. Экспрессия ТороII при Ак с разным наибольшим размером новообразования (а, в, д – 3 см; б, г, е - 3 см) и разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома).

Иммуногистохимический метод, х400.

более 3 см), гистогенез (Ак и Пк), дифференцировка (высокая и умеренаянизкая) (рисунок 22,23). ИМ ТороII при НМКРЛ имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,25, р0,001), дифференцировкой (r=0,23, р0,01) и умеренную корреляцию с гистогенезом (r=0,38, р0,001). Таким образом, активность ТороII увеличивается в процессе увеличения размера НМКРЛ и при Пк по сравнению с Ак. В опухолях без солидизации (высокодифференцированные) по сравнению с опухолями с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференцированные) минимальный ИМ ТороII.

Вероятно, при Ак, в процессе роста и снижении дифференцировки опухоли происходит увеличение активности ТороII, связанное как с увеличением пролиферативной активности опухоли, так и с изменением функциональных процессов мутированной ДНК.

Результаты определения ИМ ТороII в Ак во взаимосвязи связи с клинико-морфологическими параметрами представлены в таблице 45.

–  –  –

Рисунок 23. Экспрессия ТороII при Пк с разным наибольшим размером новообразования (а, в, д – 3 см; б, г, е - 3 см) и разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома).

Иммуногистохимический метод, х400.

В Ак ИМ ТороII составил 14 (6-21)%; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,84, р0,001). Минимальное значение выборки составило 1%, максимальное – 80%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,81) и значительной островершинностью (эксцесс 4,50) (рисунок 21б).

Отмечалось последовательное увеличение ИМ ТороII в Ак в группах

Т1, Т2, Т3 (показатель Т), N0, N1, N2 (показатель N), I, II, III (стадия заболевания), однако, статистически значимого отличия не было получено. Статистически значимые отличия ИМ ТороII получены в следующих группах:

наибольший размер опухоли (до 3 см и более 3 см), дифференцировка (высокая и умереная-низкая) (рисунок 22). ИМ ТороII в Ак имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,25, р=0,02), дифференцировкой (r=0,33, р=0,002). Таким образом, активность ТороII увеличивается в процессе увеличения размера Ак. Также в опухолях без солидизации (высокодифференцированные) по сравнению с опухолями с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференцированные) минимально содержание ТороII.

–  –  –

В Пк ИМ ТороII составил 22 (16-28)%; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,89, р0,001). Минимальное значение выборки составило 5%, максимальное – 64%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,33) и значительной островершинностью (эксцесс 2,12) (рисунок 21в). Результаты определения ИМ ТороII в эпителиальных клетках Пк в связи с клиникоморфологическими параметрами, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице 46.

ИМ ТороII возрастал в в группах Т1, Т2, Т3, однако, статистически значимое отличие получено только между Т3 и Т1, Т2. Также отмечалось достоверное отличие ИМ ТороII между опухолями до 3 см и более 3 см (рисунок 23). Отмечалось последовательное увеличение ИМ ТороII в группах N0, N1, N2, N3 (показатель N), однако, статистически значимого отличия не было получено. Достоверное отличие ИМ ТороII получено между I и III стадиями заболевания, высоко- и низкодифференцированной опухолью (рисунок 23).

ИМ ТороII в Пк имел слабую корреляцию с показателем Т (r=0,20, р=0,04), наибольшим размером опухоли (r=0,23, р=0,02), стадией (r=0,24, р=0,01).

5.4. Топоизомераза II и молекулярно-биологические маркеры

Результаты определения ИМ ТороII при НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 47. Так как при НМКРЛ медиана ИМ ТороII составила 19%, то случаи с ИМ ТороII 19% и более считались с большим ИМ ТороII (99 случаев – 52%), до 19% – с небольшим (94 случая – 48%).

В НМКРЛ при увеличении ИМ ТороII отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП и ИМ Ki-67. Также в группе опухолей с большим ИМ ТороII отмечалось большее количество р53 и bax положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При НМКРЛ ИМ ТороII имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,32, р0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,26, р0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,26, р0,001), ПП (r=0,52, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,68, р0,001), р53 положительной экспрессией (r=0,21, р0,05), bax положительной экспрессией (r=0,19, р0,05) и амплификацией гена Her2 (r=0,16, р0,05).

–  –  –

Результаты определения ИМ ТороII при Ак во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 48. Так как при Ак медиана ИМ ТороII составила 14%, то случаи с ИМ ТороII 14% и более считались с большим ИМ ТороII (42 случая – 51%), до 14% – с небольшим (40 случаев – 49%).

В Ак при увеличении ИМ ТороII отмечалось увеличение количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП и ИМ Ki-67. Также в группе опухолей с большим ИМ ТороII отмечалось большее количество р53 и bcl-2 положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При Ак ИМ ТороII имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,35, р0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,31, р0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,32, р0,01), ПП (r=0,57, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,71, р0,001), р53 и bcl-2 положительной экспрессией (соответственно r=0,25, р0,01 и r=-0,22, р0,05) и амплификацией гена Her2 (r=0,22, р0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИМ ТороII с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ, за исключением ИП Ag-ЯОР-белков и экспрессии bax – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Ак. Однако, при Ак по сравнению с НМКРЛ отмечается корреляция ИМ ТороII с экспрессией bcl-2.

–  –  –

Результаты определения ИМ ТороII при Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 49. Так как при Пк медиана ИМ ТороII составила 22%, то случаи с ИМ ТороII 22% и более считались с большим ИМ ТороII (61 случай – 55%), до 22% – с небольшим (50 случаев – 45%).

В Пк при увеличении ИМ ТороII отмечалось увеличение количественных показателей ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП и ИМ Ki-67. При Пк ИМ ТороII имел корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,36, р0,001), КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,29, р0,001), ПП (r=0,29, р=0,01), ИМ Ki-67 (r=0,73, р0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИМ ТороII с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением Ag-ЯОР-белков (MIB-1), экспрессии р53, bax и амплификации гена Her2 – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк.

–  –  –

Суммируя данные результатов исследования ИМ Ki-67 и ИМ ТороII следует отметить следующие основные моменты. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое повышение ИМ Ki-67 и ИМ ТороII по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Имеется гендерная взаимосвязь с ИМ Ki-67 и ИМ ТороII, так как найдено статистически значимое увеличение ИМ Ki-67 и ИМ ТороII у лиц мужского пола по сравнению с женским. ИМ Ki-67 и ИМ ТороII был взаимосвязан с основными клиникоморфологическими параметрами по системе TNM: наибольшим размером опухоли, гистогенезом и дифференцировкой.

Также ИМ Ki-67 и ИМ ТороII имел корреляцию с большинством молекулярно-биологических маркеров:

ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белками (MIB-1), ПП, р53 и bax положительной экспрессией и амплификацией гена Her2. Таким образом, исследование ИМ Ki-67 и ИМ ТороII является важной молекулярно-биологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования.

ГЛАВА 6. МАРКЕРЫ АПОПТОЗА

Результат иммуногистохимической окраски определялся в виде окрашивания - от светло- до темно-коричневого оттенка. Ядерное равномерное окрашивание было характерным для р53 и цитоплазматическое гранулярное окрашивание - для bcl-2 и bax. В неизмененном эпителии альвеол отсутствовала экспрессия p53, bcl-2 и bax. В неизмененном эпителии бронхов отсутствовали p53-положительные клетки. В неизмененном эпителии бронхов bclположительные клетки определялись только в базальном слое, ИМ bcl-2 составил менее 10%. В неизмененном эпителии бронхов bax-положительные клетки определялись во всех слоях, ИМ bax составил более 90% (рисунок 24). В клетках НМКРЛ наблюдалось повышение экспрессии p53, bcl-2 и bax по сравнению с неизмененным эпителием альвеол (р0,001). В клетках НМКРЛ наблюдалось повышение экспрессии p53 и bcl-2 и снижение экспрессии bax по сравнению с неизмененным эпителием бронхов (р0,001).

Экспрессия р53, bcl-2 и bax исследована в 237 НМКРЛ, из них 109 Ак и 128 Пк.

Рисунок 24. Экспрессия bcl-2 (а) и bax (б) в неизмененном эпителии бронхов. Иммуногистохимический метод, х400.

6.1. p53, bcl-2, bax и клинико-морфологические параллели При НМКРЛ положительная экспрессия р53 определялась в 104 случаях (44%) и в 133 случаях (56%) отрицательная экспрессия, положительная экспрессия bcl-2 определялась в 43 случаях (18%) и в 194 случаях (82%) отрицательная экспрессия, положительная экспрессия bax определялась в 130 случаях (55%) и в 107 случаях (45%) отрицательная экспрессия.

Таблица 50. Возраст и пол больных НМКРЛ, Ак, Пк и экспрессия p53, bcl-2, bax (абсолютное количество (%)).

–  –  –

Результаты определения экспрессии р53, bcl-2 и bax при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 50. Найдено статистически значимое увеличение положительной экспрессии bax при НМКРЛ у лиц женского пола по сравнению с мужским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с экспрессией р53, bcl-2 и bax. Пол больных НМКРЛ и Ак имел слабую корреляцию с положительной экспрессией bax (соответственно r=0,18 и r=0,20, р0,05).

Результаты исследования экспрессии р53, bcl-2 и bax при НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами представлены в таблице 51. Найдено статистически значимое увеличение количества случаев с положительной экспрессией р53 при Пк по сравнению с Ак (р0,05) – соответственно 65 случаев (51%) и 39 случаев (36%). Отмечается достоверное увеличение количества случаев с положительной экспрессией bcl-2 в группе опухолей без метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями с наличием метастазов (р0,05; соответственно 34 случая (23%) и 9 случаев (10%)), при I стадии заболевания по сравнению со II-III стадиями (р0,01; соответственно 30 случаев (25%) и 13 случаев (11%)), а также в Пк по сравнению с Ак (р0,05; соответственно 30 случаев (23%) и 13 случаев (12%)). Количество случаев с положительной экспрессией bax достоверно больше в Ак по сравнению с Пк (р0,05; соответственно 69 случаев (63%) и 61 случай (48%)). В НМКРЛ гистогенез имел слабую корреляцию с р53 (r=0,15, р0,05), bcl-2 (r=0,15, р0,05) и bax (r=0,16, р0,05), показатель N и стадия процесса с bcl-2 (r=0,15, р0,05 и r=0,18, р0,01 соответственно).

Таблица 51. Положительная экспрессия p53, bcl-2, bax и клиникоморфологические параметры при НМКРЛ (абсолютное количество (%)).

–  –  –

Рисунок 25. Положительная экспрессия р53 при НМКРЛ разного гистогенетического типа (а, в, д – при Ак; б, г, е – при Пк) и с разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома).

Иммуногистохимический метод, х400.

Таким образом, гистогенез НМКРЛ взаимосвязан с экспрессией р53 (выше при Пк), bcl-2 (выше при Пк) и bax (выше при Ак), что вероятно, отражает взаимосвязь особенностей генетических нарушений и гистогенеза опухоли (рисунок 25, 26, 27). При появлении метастатического потенциала и в более поздних стадиях экспрессия белка bcl-2 снижается, что указывает и на снижение антиапоптотического влияния этого белка.

При Ак положительная экспрессия р53 определялась в 39 случаях (36%) и в 89 случаях (64%) отрицательная экспрессия, положительная экспрессия bcl-2 определялась в 13 случаях (12%) и в 96 случаях (88%) отрицательная экспрессия, положительная экспрессия bax определялась в 69 случаях (63%) и в 40 случаях (37%) отрицательная экспрессия. Результаты исследования р53, и при Ак во взаимосвязи с клиникоbcl-2 bax морфологическими параметрами представлены в таблице 52.

Не найдено статистически значимого отличия и корреляции количества случаев с положительной экспрессией р53, bcl-2 и bax в зависимости от клинико-морфологических параметром Ак – показателя Т, наибольшего размера опухоли, показателя N, стадии заболевания и дифференцировки. Таким образом, отсутствует взаимосвязь положительной экспрессии р53, bcl-2 и bax с клинико-морфологическими параметрами Ак.

Таблица 52. Положительная экспрессия p53, bcl-2, bax и клиникоморфологические параметры при Ак (абсолютное количество (%)).

–  –  –

Рисунок 26. Положительная экспрессия bcl-2 при НМКРЛ разного гистогенетического типа (а, в, д – при Ак; б, г, е – при Пк) и с разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома).

Иммуногистохимический метод, х400.

При Пк положительная экспрессия р53 определялась в 65 случаях (51%) и в 63 случаях (49%) отрицательная экспрессия, положительная экспрессия bcl-2 определялась в 30 случаях (23%) и в 98 случаях (77%) отрицательная экспрессия, положительная экспрессия bax определялась в 61 случаях (48%) и в 67 случаях (52%) отрицательная экспрессия. Результаты исследования р53, bcl-2 и bax при Пк во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами представлены в таблице 53.

–  –  –

Не найдено отличия и корреляции количества случаев с положительной экспрессией р53 и bax в зависимости от клинико-морфологических параметром Пк – показателя Т, наибольшего размера опухоли, показателя N, стадии заболевания и дифференцировки. Отмечается увеличение количества случаев с положительной экспрессией bcl-2 при I стадии заболевания по сравнению со II-III стадиями (р=0,02; соответственно 21 случай (33%) и 9 случаев (14%)), а также в группе опухолей без метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями с наличием метастазов (на уровне тенденции к статистической значимости р=0,06). В Пк положительная экспрессия bcl-2 имела слабую корреляцию со стадией заболевания (r=0,23, р=0,01) и на уровне тенденции к статистической значимости с показателем N (r=0,17, р=0,06). Таким образом, при Пк стадия заболевания и в меньшей степени показатель N взаимосвязаны с экспрессией bcl-2.

Рисунок 27. Положительная экспрессия bax при НМКРЛ разного гистогенетического типа (а, в, д – при Ак; б, г, е – при Пк) и с разной степенью дифференцировки (а, б – высокодифференцированная, в, г – умерено дифференцированная, д, е – низкодифференцированная карцинома).

Иммуногистохимический метод, х400.

Таким образом, экспрессия р53, bcl-2 и bax взаимосвязана с гистогенетическим происхождением НМКРЛ. При НМКРЛ экспрессия bcl-2 взаимосвязана с местастазированием в лимфатические узлы и стадией заболевания, данная тенденция прослеживается за счет группы Пк, так как при Ак она не наблюдается (рисунок 25, 26, 27).

6.2. p53, bcl-2, bax и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения экспрессии р53, bcl-2 и bax во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами при НМКРЛ, а также результаты сравнения представлены в таблицах 54, 55 и 56.

–  –  –

В НМКРЛ при положительной экспрессии р53 по сравнению с отрицательной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII.

При НМКРЛ экспрессия р53 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,24, р0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,20, р0,05), ПП (r=0,25, р0,001), ИМ Ki-67 (r=0,22, р0,01), ИМ ТороII (r=0,21, р0,05).

В НМКРЛ при отрицательной экспрессии bcl-2 по сравнению с положительной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков и Ag-ЯОР-белков (MIB-1). При НМКРЛ экспрессия bcl-2 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,22, р0,01) и Ag-ЯОРбелками (MIB-1) (r=0,24, р0,01).

Таблица 55. Экспрессия bcl-2 и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ.

–  –  –

В НМКРЛ при положительной экспрессии bax по сравнению с отрицательной экспрессией отмечались более высокие значения ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. При НМКРЛ экспрессия bax имела корреляцию с ПП (r=0,20, р0,01), ИМ Ki-67 (r=0,23, р0,001), ИМ ТороII (r=0,19, р0,05).

Результаты определения экспрессии р53, bcl-2 и bax во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами при Ак, а также результаты сравнения представлены в таблицах 57, 58 и 59.

Таблица 57. Экспрессия p53 и молекулярно-биологические маркеры Ак.

–  –  –

В Ак при положительной экспрессии р53 по сравнению с отрицательной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков, ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. При Ак экспрессия р53 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,29, р0,05), ПП (r=0,28, р0,05), ИМ Ki-67 (r=0,28, р0,05), ИМ ТороII (r=0,25, р0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии р53 с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ, за исключением Ag-ЯОР-белков (MIB-1) – взаимосвязь с которой отсутствовала при Ак.

В Ак при отрицательной экспрессии bcl-2 по сравнению с положительной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков и ИМ ТороII. При Ак экспрессия bcl-2 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,27, р0,05) и ИМ ТороII (r=0,22, р0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии bcl-2 с молекулярнобиологическими маркерами имели отличия - при Ак отсутствовала взаимосвязь с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) и была взаимосвязь с ИМ ТороII по сравнению с НМКРЛ.

В Ак при положительной и отрицательной экспрессии bax отсутствовали отличия в экспрессии молекулярно-биологических маркеров. Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии с молекулярноbax биологическими маркерами имели отличия - при Ак отсутствовала взаимосвязь с ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII по сравнению с НМКРЛ.

Результаты определения экспрессия р53, bcl-2 и bax во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами при Пк, а также результаты сравнения представлены в таблицах 60, 61 и 62.

Таблица 60. Экспрессия p53 и молекулярно-биологические маркеры Пк.

–  –  –

В Пк при положительной экспрессии р53 по сравнению с отрицательной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП. При Пк экспрессия р53 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,33, р0,01), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,26, р0,05), ПП (r=0,24, р0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии р53 с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением ИМ Ki-67 и ИМ ТороII – взаимосвязь с которыми отсутствовала при Пк.

В Пк при отрицательной экспрессии bcl-2 по сравнению с положительной экспрессией отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП. При Пк экспрессия bcl-2 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,31, р0,01), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,26, р0,05) и ПП (r=0,24, р0,05). Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии bcl-2 с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ; однако, при Пк отмечается взаимосвязь с ПП по сравнению с НМКРЛ.

В Пк при положительной и отрицательной экспрессии bax отсутствовали отличия в экспрессии молекулярно-биологических маркеров. Таким образом, корреляционные взаимосвязи экспрессии с молекулярноbax биологическими маркерами имели отличия - при Пк отсутствовала взаимосвязь с ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII по сравнению с НМКРЛ.

Суммируя данные результатов исследования экспрессии р53, bcl-2 и bax следует отметить следующие основные моменты. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое изменение экспрессии р53, bcl-2 и bax по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Отсутствовала гендерно-возрастная взаимосвязь с экспрессией р53, bcl-2. Экспрессия bax была выше у лиц женского пола по сравнению с мужским. Экспрессия р53, bcl-2 и bax была взаимосвязана с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: гистогенезом и для экспрессии bcl-2 - с показателем N и стадией заболевания. Также экспрессия р53, bcl-2 и bax имела корреляцию с некоторыми молекулярно-биологическими маркерами: ИП Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белками (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67, ИМ ТороII. Таким образом, исследование экспрессии р53, bcl-2 и bax является важной молекулярнобиологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования.

–  –  –

Результат иммуногистохимической окраски определялся в виде окрашивания темно-коричневого цвета эндотелиальных клеток кровеносных (антитела CD34) и лимфатических (антитела D2-40) сосудов, а также комплексов клеток без просвета.

Рисунок 28. Экспрессия CD34 (а, б) в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов и подопланина (в, г) в эндотелиальных клетках лимфатических сосудов неизмененной ткани альвеол (а, в) и бронхов (б, г). Иммуногистохимический метод, х200.

В неизмененных альвеолах ПМЦР-Г составила 86 (73-102). Лимфатические сосуды в стенке альвеол отсутствовали и определялись в межальвеолярной соединительной ткани, около кровеносных сосудов, вне состава микроциркуляторного русла. В альвеолах найдена высокая плотность кровеносных и отсутствие лимфатических сосудов, что связано с наличием газотранспортной функции и отсутствием лимфатической дренажной функции альвеол. В неизмененных бронхах ПМЦР-Г составила 22 (17-31), ПМЦР-Л – 4 (2В бронхах плотность кровеносных сосудов меньше по сравнению с альвеолами и присутствуют лимфатические сосуды, обеспечивая трофическую и дренажную функцию. В НМКРЛ наблюдалось снижение ПМЦР-Г по сравнению с альвеолами и повышение по сравнению с бронхами (р0,001), а также повышение ПМЦР-Л по сравнению с альвеолами (р0,001) и отсутствие отличия по сравнению с бронхами (рис. 28). ПМЦР-Г и ПМЦР-Л исследована в 228 НМКРЛ: 105 Ак и 123 Пк.

7.1. ПМЦР-Г и клинико-морфологические параллели Результаты определения ПМЦР-Г при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 63 и 64. Отсутствовала статистически значимая взаимосвязь пола и возраста больных НМКРЛ, Ак и Пк с ПМЦР-Г.

–  –  –

Результаты определения ПМЦР-Г во взаимосвязи с клиникоморфологическими параметрами НМКРЛ, Ак и Пк представлены в таблице

65. Не найдено статистически значимого отличия и корреляции ПМЦР-Г в зависимости от клинико-морфологических параметром НМКРЛ – показателя Т, наибольшего размера опухоли, показателя N, стадии заболевания и дифференцировки. Отмечается статистически значимое увеличение ПМЦР-Г при Ак по сравнению с Пк (р=0,01). В НМКРЛ гистогенез имел слабую корреляцию с ПМЦР-Г (r=0,16, р=0,01).

<

–  –  –

Рисунок 29. Гистограммы распределения ПМЦР-Г при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в). По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в процентах).

При НМКРЛ ПМЦР-Г составила 43 (34-60); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,97, р0,001). Минимальное значение выборки составило 7, максимальное – 98. Гистограмма распределения характеризовалась умеренным сдвигом вправо (ассиметрия 0,41) и умереннной пологостью вершины (эксцесс -0,47) (рисунок 29а).

–  –  –

При Ак ПМЦР-Г составила 47 (36-64); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,96, р0,01). Минимальное значение выборки составило 10, максимальное – 98. Гистограмма распределения характеризовалась умеренным сдвигом вправо (ассиметрия 0,42) и умеренной пологостью вершины (эксцесс -0,51) (рисунок 29б).

При Пк ПМЦР-Г составила 40 (30-59); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,97, р=0,02). Минимальное значение выборки составило 7, максимальное – 93. Гистограмма распределения характеризовалась умеренным сдвигом вправо (ассиметрия 0,38) и умеренной пологостью вершины (эксцесс -0,55) (рисунок 29в).

Не найдено статистически значимого отличия и корреляции ПМЦР-Г в зависимости от клинико-морфологических параметром Ак и Пк – показателя Т, наибольшего размера опухоли, показателя N, стадии заболевания и дифференцировки (рисунок 30, 31).

Рисунок 30. ПМЦР-Г при высокодифференцированной (а, б), умерено дифференцированной (в, г) и низкодифференцированной (д, е) Ак. а, в, д - небольшая ПМЦР-Г, б, г, е - большая ПМЦР-Г.

Иммуногистохимический метод, х200.

Рисунок 31. ПМЦР-Г при высокодифференцированном (а, б), умерено дифференцированном (в, г) и низкодифференцированном (д, е) Пк. а, в, д - небольшая ПМЦР-Г, б, г, е - большая ПМЦР-Г.

Иммуногистохимический метод, х200.

7.2. ПМЦР-Г и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения ПМЦР-Г при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблицах 66, 67 и 68. В НМКРЛ и Пк при небольшой и большой ПМЦР-Г отсутствовали статистически значимые отличия в экспрессии молекулярно-биологических маркеров.

–  –  –

В Ак при большой ПМЦР-Г по сравнению с небольшой отмечались более высокие количественные показатели ИП Ag-ЯОР-белков и Ag-ЯОРбелков (MIB-1). При Ак ПМЦР-Г имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,21, р0,05) и Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,23, р0,05).

7.3. ПМЦР-Л и клинико-морфологические параллели Результаты определения ПМЦР-Л при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 63 и 64. Отсутствовала статистически значимая взаимосвязь пола и возраста больных НМКРЛ, Ак и Пк с ПМЦР-Л.

Результаты определения ПМЦР-Л во взаимосвязи с клиникоморфологическими параметрами НМКРЛ, Ак и Пк представлены в таблице

69. ПМЦР-Л при НМКРЛ составила 4 (2-9); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,70, р0,001). Минимальное значение выборки составило 1, максимальное – 46. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 2,29) и значительной островершинностью (эксцесс 5,35) (рисунок 32а).

ПМЦР-Л при Ак составила 4 (2-10); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,74, р0,001). Минимальное значение выборки составило 1, максимальное – 41. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 1,93) и значительной островершинностью (эксцесс 3,61) (рисунок 32б).

Рисунок 32. Гистограммы распределения ПМЦР-Л при НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в).

По оси Х – количественные значения, по оси Y - относительное содержание (в %).

–  –  –

Рисунок 33. ПМЦР-Л при высокодифференцированной (а, б), умерено дифференцированной (в, г) и низкодифференцированной (д, е) Ак. а, в, д - небольшая ПМЦР-Л, б, г, е - большая ПМЦР-Л.

Иммуногистохимический метод, х200.

ПМЦР-Л при Пк составила 4 (2-8); распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,66, р0,001). Минимальное значение выборки составило 1, максимальное – 46. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 2,58) и значительной островершинностью (эксцесс 6,88) (рисунок 32в).

Рисунок 34. ПМЦР-Л при высокодифференцированном (а, б), умерено дифференцированном (в, г) и низкодифференцированном (д, е) Пк. а, в, д - небольшая ПМЦР-Л, б, г, е - большая ПМЦР-Л.

Иммуногистохимический метод, х200.

Не найдено отличия и корреляции ПМЦР-Л в зависимости от клиникоморфологических параметров НМКРЛ, Ак и Пк – показателя Т и N, наибольшего размера, стадии, гистогенеза и дифференцировки (рис. 33, 34).

7.4 ПМЦР-Л и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения ПМЦР-Л при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблицах 70, 71 и 72.

–  –  –

В НМКРЛ, Ак и Пк при небольшой и большой ПМЦР-Г отсутствовали статистически значимые отличия в экспрессии молекулярно-биологических маркеров.

Суммируя данные результатов исследования ПМЦР-Г и ПМЦР-Л следует отметить следующие основные моменты. При НМКРЛ по сравнению с неизмененным легким наблюдались статистически значимые отличия ПМЦР-Г и ПМЦР-Л, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Отсутствовала гендерная взаимосвязь с ПМЦР-Г и ПМЦРЛ. ПМЦР-Г имела взаимосвязь с только гистогенезом. Также ПМЦР-Г имела корреляцию с незначительным количеством молекулярно-биологических маркеров - ИП Ag-ЯОР-белков и Ag-ЯОР-белками (MIB-1). Отсутствовала взаимосвязь ПМЦР-Л с основными клинико-морфологическими и молекулярно-биологическими параметрами.

ГЛАВА 8. СТАТУС БЕЛКА И ГЕНА HER2

Результат иммуногистохимической окраски на белок Her2 определялся в виде мембранного окрашивания, от светло- до темно-коричневого цвета. В неизмененном эпителии альвеол и бронхов отсутствовала положительная экспрессия белка Her2. В неизмененном эпителии бронхов определялось фрагментарное мембранное ИГХ окрашивание на Her2 в единичных клетках (до 10%). В клетках НМКРЛ наблюдалось повышение экспрессии белка Her2 по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р0,001). В ядрах клеток неизмененного эпителия альвеол и бронхов определялись от 1 до 2 гранул черного цвета (ген Her2) - чаще одна, от 1 до 2 гранул красного цвета (СЕР17) - чаще одна; соотношение Her2/CEP17 не превышало значения 1,8 (рисунок 35). Таким образом, в неизмененном эпителии альвеол и бронхов отсутствовала амплификация гена Her2 и увеличение СЕР17. Экспрессия белка Her2 и статус гена Her2, СЕР17 исследованы в 218 НМКРЛ, из них 99 Ак и 119 Пк.

Рисунок 35. Статус гена Her2 и СЕР17 в неизмененной ткани альвеол (а) и бронхов (б). SISH метод, а - х200, б, в, г – х1000.

8.1. Статус белка Her2 и клинико-морфологические параллели При НМКРЛ положительный Her2 статус определен в 106 случаях (49%) и в 112 случаях (51%) отрицательный. При Ак положительный Her2 статус определен в 61 случае (62%) и в 38 случаях (38%) отрицательный. При Пк положительный Her2 статус определен в 45 случаях (38%) и в 74 случаях (62%) отрицательный.

Результаты определения экспрессии белка Her2 при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 73. Отсутствовала статистически значимая взаимосвязь пола и возраста больных НМКРЛ, Ак и Пк с положительным Her2 статусом опухоли.

–  –  –

Результаты исследования экспрессии белка Her2 при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами опухоли представлены в таблице 74. При НМКРЛ отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с положительным Her2 статусом в группе опухолей с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями без метастазов - соответственно 44 (58%) и 62 (44%) случаев (р=0,048). Количество случаев с положительным Her2 статусом достоверно больше при Ак, чем при Пк - соответственно 61 (62%) и 45 (38%) случаев (р0,001) (рисунок 36). Положительный Her2 статус НМКРЛ имел слабую корреляцию с показателем N (r=0,14, р=0,04) и гистогенезом (r=0,24, р0,001). Таким образом, содержание белка Her2 в НМКРЛ взаимосвязано с гистогенезом и метастатическим потенциалом опухоли.

Рисунок 36. Иммуногистохимический статус белка Her2 при НМКРЛ: а, б – 1 балл (+), в, г – 2 балла (++), д, е – 3 балла (+++). а, в, д – Ак, б, г, е - Пк.

Иммуногистохимический метод, х200.

Таблица 74. Положительная экспрессия белка Her2 и клиникоморфологические параметры НМКРЛ, Ак и Пк (абсолютное количество (%)).

–  –  –

При Ак отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с положительным Her2 статусом в группе опухолей с наибольшим размером более 3 см по сравнению с опухолями до 3см - соответственно 34 (66%) и 27 (56%) случаев (р=0,03). Отсутствовало статистически значимое отличие и корреляции количества случаев с положительным Her2 статусом в зависимости от клинико-морфологических параметром Ак – показателя Т и N, стадии заболевания и дифференцировки. Положительный Her2 статус Ак имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,21, р=0,03) (рисунок 36). Таким образом, содержание белка Her2 в Ак взаимосвязано только с наибольшим размером опухоли.

При Пк отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с положительным Her2 статусом в группе опухолей с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями без метастазов - соответственно 22 (55%) и 23 (29%) случаев (р=0,009). При Пк отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с положительным Her2 статусом в группе опухолей со II-III стадиями заболевания по сравнению с опухолями с I стадией - соответственно 28 (47%) и 17 (28%) случаев (р=0,04).

Отсутствовало статистически значимое отличие и корреляции количества случаев с положительным Her2 статусом в зависимости от клиникоморфологических параметром Ак – показателя Т, наибольшего размера опухоли и дифференцировки. Положительный Her2 статус Пк имел умеренную корреляцию с показателем N (r=0,31, р=0,006) и стадией заболевания (r=0,21, р=0,03) (рисунок 36). Таким образом, содержание белка Her2 в Пк взаимосвязано со стадией заболевания и метастатическим потенциалом опухоли.

8.2. Статус белка Her2 и молекулярно-биологические маркеры Результаты определения ИГХ Her2 статуса при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблицах 75, 76 и 77.

Таблица 75. ИГХ Her2 статус и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ.

–  –  –

В НМКРЛ и Пк при положительном ИГХ Her2 статусе отмечались достоверно большие значения Ag-ЯОР-белков (MIB-1); в Ак данные отличия были не достоверны. При НМКРЛ и Пк ИГХ Her2 статуса коррелировал с Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (соответственно r=0,17, р0,05 и r=0,21, р0,01). В НМКРЛ, Пк и Ак только при положительном ИГХ Her2 статусе отмечалась амплификация гена Her2, при отрицательном ИГХ Her2 статусе отсутствовала амплификация гена Her2. При НМКРЛ, Пк и Ак отмечалась умеренная корреляция между ИГХ Her2 статусом и амплификацией гена Her2 (соответственно r=0,32, р0,001 и r=0,48, р0,001 и r=0,23, р0,05).

Таблица 76. ИГХ Her2 статус и молекулярно-биологические маркеры Ак.

–  –  –

8.3. Статус гена Her2 и клинико-морфологические параллели Результаты определения статуса гена Her2, CEP17 при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 73. Найдено статистически значимое увеличение количества случаев с амплификацией гена Her2 при НМКРЛ у лиц женского пола по сравнению с мужским. Однако, при Ак и Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с статусом гена Her2, CEP17. Пол больных НМКРЛ имел слабую корреляцию с амплификацией гена Her2 (r=0,14, р=0,04).

–  –  –

Кросстабулированные данные исследования гена Her2 и CEP17 в эпителиальных клетках НМКРЛ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами опухоли представлены в таблице 78.

Рисунок 37. Статус гена Her2 и СЕР17 при НМКРЛ: а - высокий уровень (в нижней части) и низкий уровень (в верхней части) амплификации гена Her2 в умерено дифференцированной аденокарциноме, б -низкий уровень амплификации гена Her2 в умерено дифференцированной аденокарциноме, в - амплификация гена Her2 совместно с увеличением СЕР17 в высокодифференцированной аденокарциноме, г - увеличение СЕР17 в высокодифференцированном плоскоклеточном раке. SISH метод, а - х200, б, в, г – х1000.

Хромогенная гибридизация in situ показала, что амплификация гена Her2 была в 19 (9%) случаях, увеличение CEP17 в 26 (12%) случаях. В 4 случаях (2%) Ак амплификация гена Her2 (без увеличения CEP17) определялась в виде кластеров (12 и более копий) и соответствовала высокому уровню амплификации. В остальных 15 случаях (7%) амплификация гена Her2 определялась в виде отдельных множественных копий (от 4 до 8) и соответствовала низкому уровню амплификации, из которых, в 7 (3%) случаях – низкий уровень амплификации гена Her2 совместно с увеличением CEP17 и в 8 (4%) случаях - низкий уровень амплификации гена Her2 и отсутствие увеличения CEP17 (рисунок 37б,в,г). Во всех случаях увеличение CEP17 было незначительной степени (до 4 красных меток). Во всех исследованных нами случаях отсутствовала внутриопухолевая гетерогенность амплификации гена Her2.

Однако в одном из четырех случаев аденокарциномы легкого с высоким уровнем амплификации гена Her2 найдена неоднородность амплификации гена Her2: в участках опухоли с железистоподобным строением отмечался низкий уровень амплификации гена Her2, а в участках солидизации - высокий уровень амплификации гена Her2 (рисунок 37а).

Количество случаев с амплификацией гена Her2 достоверно больше при Ак по сравнению с Пк - соответственно 16 (16%) и 3 (3%) случая (р0,001). Другие клинико-морфологические параметры НМКРЛ (показатель Т и N, наибольший размер опухоли, стадия заболевания и дифференцировка) не имели взаимосвязи с амплификацией гена Her2. Отмечалось статистически значимое увеличение количества случаев с увеличением CEP17 в группе опухолей с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолями без метастазов - соответственно 14 (18%) и 12 (8%) случаев (р=0,047).

Другие клинико-морфологические параметры НМКРЛ (показатель Т, наибольший размер опухоли, стадия заболевания, гистогенез и дифференцировка) не имели взаимосвязи с состоянием CEP17. Состояние гена Her2 имело слабую корреляцию с гистогенезом опухоли (r=0,24, р0,001), а состояние CEP17 - с показателем N (r=0,15, р=0,03).

Таким образом, при НМКРЛ состояние гена Her2 взаимосвязано с гистогенезом, а состояние CEP17 - с метастатическим потенциалом опухоли.

8.4 Статус гена Her2 и молекулярно-биологические маркеры

Результаты определения статуса гена Her2 при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблицах 79, 80 и 81. В НМКРЛ и Ак при амплификации гена Her2 отмечались достоверно большие значения ИП Ag-ЯОРбелков, ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII; в Пк данные отличия были не достоверны. При НМКРЛ амплификации гена Her2 имела корреляцию с ИП AgЯОР-белков (r=0,14, р0,05), ПП (r=0,21, р0,01), ИМ Ki-67 (r=0,16, р0,05), ИМ ТороII (r=0,16, р0,05). При Ак амплификации гена Her2 имела корреляцию с ИП Ag-ЯОР-белков (r=0,24, р0,05), ПП (r=0,26, р0,05), ИМ Ki-67 (r=0,21, р0,05), ИМ ТороII (r=0,22, р0,05). В НМКРЛ, Пк и Ак амплификация гена Her2 коррелировала с положительным ИГХ Her2 статусом (соответственно r=0,32, р0,001 и r=0,48, р0,001 и r=0,23, р0,05).

Таблица 79. Статус гена Her2 и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ.

–  –  –

Суммируя данные результатов исследования ИГХ Her2 статуса и состояния гена Her2 следует отметить следующие основные моменты. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое изменение ИГХ Her2 статуса и состояния гена Her2 по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Имеется гендерная взаимосвязь с состоянием гена Her2 – амплификация гена Her2 чаще у лиц женского пола по сравнению с мужским. ИГХ Her2 статус и состояния гена Her2 были взаимосвязаны с основными клиникоморфологическими параметрами по системе TNM: показателем N и гистогенезом. Также ИГХ Her2 статус и состояние гена Her2 имели корреляцию с некоторыми молекулярно-биологическими маркерами: ИП Ag-ЯОР-белков, площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателем пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороII. Таким образом, исследование ИГХ Her2 статуса и состояния гена Her2 является важной молекулярно-биологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования.

ГЛАВА 9. АНАЛИЗ ВЫЖИВАЕМОСТИ

Общая скорректированная выживаемость больных НМКРЛ за 5-летний период после операции составила 41,3±3,5%. Выживаемость больных НМКРЛ исследована во взаимосвязи с клиническими критериями, клиникоморфологическими параметрами и коэкспрессии молекулярно-биологических маркеров.

–  –  –

Результаты определения выживаемости больных НМКРЛ во взаимосвязи с клиническими критериями, а также результаты сравнения представлены в таблице 82.

Таблица 82. Выживаемость и клинические критерии НМКРЛ.

–  –  –

Так как при НМКРЛ средний возраст составил 59 лет, то все случаи были поделены на группу с возрастом до 59 лет и группу старше 59 лет. Выживаемость больных НМКРЛ не имела статистически значимого отличия между группами с возрастом до 59 лет и старше 59 лет. Также выживаемость больных НМКРЛ не имела статистически значимого отличия в зависимости от половой принадлежности.

Рисунок 38. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ после проведения лобэктомии и пневмонэктомии. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных.

Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р=0,007) в зависимости от типа операции: 45,4±4,2% - при лобэктомии и 29,3±6,0% - при пневмонэктомии (рисунок 38).



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |
Похожие работы:

«формой устанавливали путем сравнения профилей амплифицированных ПЦРпродуктов. Синтезированные в процессе исследования Semi-RAPD праймеры могут быть рекомендованы для генотипирования выделенных и идентифицированных клонов. УДК...»

«1 КОМИТЕТ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО КОМПЛЕКСА МУРМАНСКОЙ ОБЛАСТИ ПРОТОКОЛ заседания комиссии по проведению конкурса на право заключения договора о предоставлении рыбопромыслового участка для осуществления промышленного рыболовства в отношении водных биологических ресурсов внутренних вод Российской Ф...»

«ГАЗОВАЯ ОТРАСЛЬ ОРЕНБУРГСКОЙ ОБЛАСТИ, ЕЁ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ Горягина А.С. Данилова А.В. Оренбургский государственный университет, г. Оренбург Газовая отрасль в Оренбургской области возникла не давно и за короткий срок стала одной из ведущих в её промышленности. Она во многом принесла массу экономических преимуществ, н...»

«общества. На это, как правило, социологи обращают внимание. Однако в не меньшей степени проблема социальной перспективы должна быть связана с биологической составляющей, т.к. социальная (рациональная) составляющая человека интенционально, как потенциал отдаленного будущего, пред...»

«РАЗРАБОТАНА УТВЕРЖДЕНА Кафедрой физиологии и морфолоУченым советом гии человека и животных Биологического факультета 06.03.2014, протокол № 87 13.03.2014, протокол № 5 ПРОГРАММА ВСТУПИТЕЛЬНОГО ИСПЫТАНИЯ для...»

«Моросанова Мария Александровна Механизмы повреждения клеток эпителия почечных канальцев при моделировании пиелонефрита in vitro 03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА Работа выполнена на факультете биоинженери...»

«Прайс-лист от 03.08.2016г Адрес: 121351, г. Москва, ул. Молодогвардейская, 57. Телефон: +7 (495) 642-93-62, +7 (495) 642-93-63. www.paliart.ru Цена Наименование товаров (включая НДС и НП...»

«Секция 1: Экологические основы прогрессивных технологий 6. Сеитбурханов А.Г. Научно-методические основы сохранения водных, земельных и биологических ресурсов Кыргызстана // Синергия. 2015. № 2. С. 53-62.7. Шароховская...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Тульский государственный университет Белорусский национальный технический университет Донецкий национальный технический университет Правительство Тульской области Научнообразовательный центр геоинженерии, строительной механики и материалов 12-я...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г.ЧЕ...»

«ЗАГАЛЬНІ ПРОБЛЕМИ УДК [577.23+615.95]574.64 В.В. Г Р У Б И Н К О Тернопольский национальный педагогический университет им. Владимира Гнатюка ул. М. Кривоноса, 2, Тернополь, 46027, Украина СИСТЕМНЫЙ ПОДХОД В ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ ТОКСИЧНОСТИ ВОДНОЙ СРЕДЫ В статье рассматривается п...»

«Математическая биология и биоинформатика. 2012. Т. 7. № 2. С. 425-443. http://www.matbio.org/2012/Avilov_7_425.pdf ====================МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ =================== УДК:004.94:519.7 Агентные модели: анализ подходов и возможности приложения к эпидемио...»

«КНАУФ-суперлист – высококачественная экологически чистая разновидность гипсоволокнистых листов, ГВЛ. Предназначен для строительных отделочных работ сухим способом. Производится по ГОСТ Р 51829-2001 прессованием смеси гипсового вяжущего и волокон распушенной макулатуры, равномерно распределенных по всему объему листа. Общие сведения...»

«Ч. АЮУШСУРЭН1, А. ДУЛМАА2 ( 1Институт биологии АНМ, Улаанбаатор, Монголия, 2Иркутский государственный университет, Иркутск, ayush_ch21@yahoo.com) ЗООПЛАНКТОН ОЗЕР БАССЕЙНА УЛААГЧНЫ ХАР Озера Улаагчны Хар, Бага, Жаахан расположены в Западно...»

«Казарьян Константин Александрович Биохимические и иммунологические свойства белков семейства Rpf – факторов роста Micrococcus luteus и Mycobacterium tuberculosis 03.00.04 – Биохи...»

«СОЧИНСКИЙ ИНСТИТУТ (ФИЛИАЛ) федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования "РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ" (РУДН) ЮРИДИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ АННОТАЦИЯ УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ Образоват...»

«Всеро оссийская науучно-практич ческая конфер ренция "Экологи и безопасн ия ность в технос сфере: соврем менные проб блемы и пути решения"4. Куччерик Г.В. Виикористання електродіалі для вилуч ізу чення хлорид та сульфат з лужних регенедів тів рацційних ро...»

«ВОСТОЧНОЕВРОПЕЙСКИЙ БОТАНИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК. 2007. № 2. С.181-227. УДК 581.9 (471.56) РАСТИТЕЛЬНОСТЬ КАМЕНИСТОЙ СТЕПИ ЖИГУЛЕВСКИХ ГОР СИСТЕМАТИЧЕСКИЙ ПЕРЕЧЕНЬ ВИДОВ ФЛОРЫ Л.М. Черепнин * ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРА Начиная с этого номера, мы начина...»

«"ПЕДАГОГИКО-ПСИХОЛОГИЧЕСКИЕ И МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ И СПОРТА" Электронный журнал Камского государственного института физической культуры Рег.№ Эл №ФС77-27659 от 26 марта 2007г №6 (1/...»

«2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ.. 4 Глава 1. ГЕОЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СЕЙСМИЧЕСКОЙ ОПАСНОСТИ И РИСКА. ПРОБЛЕМЫ И РЕШЕНИЯ. 11 1.1. Анализ литературных данных и постановка задачи. 11 1.2. Исходные материалы и методика исследований. 26 1.3. Основные выводы.. 35 Глава 2. РЕГИОНАЛЬНЫЕ И ЛОКАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ И ОЦЕНКИ ДОЛГ...»

«РЕАЛИЗАЦИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТНОГО ПОДХОДА В ОРГАНИЗАЦИИ ПРАКТИЧЕСКИХ ДОМАШНИХ РАБОТ ПО БИОЛОГИИ Глухова А. С., Боброва Н. Г. Поволжская государственная социально-гуманитарная академия Самара, Россия Деятельностный подход заявлен в федеральном государственном стандарте основного общего образования как м...»

«Остроумов С.А. Концепции экологии экосистема, биогеоценоз, границы экосистем: поиск новых определений // Вестник МГУ. Серия 16. Биология. 2003. № 3. С.43-50. Табл. Рез. на англ. яз. Библиогр. 44 назв. [Нов. трактовка, н...»

«1. Вольф Бавария 2. Основы звукоизоляции 3. Инструкция по монтажу 4. PhoneStar на полу 5. PhoneStar на стене 6. PhoneStar на потолке Промышленная звукоизоляция 7. Материалы и комплектующие 8. Сертификаты 9. special Инструкция по монтажу Общая информация PhoneStar – инновационная звукоиз...»

«КУЯНЦЕВА Надежда Борисовна РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПРИБРЕЖНО-ВОДНЫХ МЕСТООБИТ АНИЙ НА ЮЖНОМУРАЛЕ 03.00.05ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург Работа выполнена в Институте экологии растений и животных Уральского от...»








 
2017 www.net.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.