WWW.NET.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Интернет ресурсы
 

Pages:   || 2 |

«НА ПРАВАХ РУКОПИСИ ОРЛОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ДАРБЭПОЭТИНА АЛЬФА В ПРОЦЕССЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА 03.01.06 - ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное унитарное предприятие

«Государственный научно-исследовательский институт генетики и

селекции промышленных микроорганизмов»

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

ОРЛОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА

ДАРБЭПОЭТИНА АЛЬФА В ПРОЦЕССЕ

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА

БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

ДОКТОР МЕДИЦИНСКИХ НАУК, ПРОФЕССОР,

Р.А. Хамитов МОСКВА-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Влияние степени гликозилирования на биологическую активность белка

1.2. Особенности структуры, физических и биологических свойств эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина

1.3. Дженерики и проблемы воспроизведенных лекарственных препаратов

1.4. Краткая схема технологического процесса

1.5. Методы оценки качетва дарбэпоэтина альфа

1.6. Валидация аналитических методик в процессе биотехнологического производства лекарственных средств



2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Разработка методики оценки концентрации дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса производства

2.2.2. Валидация разработанных хроматографических методик количественного определения дарбэпоэтина

2.2.3. Разработка методики оценки степени гликозилирования дарбэпоэтина

2.2.4. Валидация методики установления подлинности дарбэпоэтина с помощью изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом.

2.2.5. Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса

2.2.6. Стандартизация конечного продукта

2.2.7. Создание стандартного образца предприятия дарбэпоэтина........... 96

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ

ВЫВОДОВ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭПО – эритропоэтин ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ОФ ВЭЖХ – обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография КЗЭ – капиллярный зональный электрофорез ГЛФ – готовая лекарственная форма RSD – относительное стандартное отклонение ПААГ – полиакриламидный гель ИФА – иммуно-ферментный анализ ПКО – предел количественного определения BRP – Biological Reference Preparation (биологический стандартный препарат)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В современной науке и медицине в последнее время появляется все больше и больше лекарственных средств на основе рекомбинантных белков, направленных на лечения широкого спектра болезней.

Создание эффективных и безопасных лекарственных средств с использованием методов генной инженерии на всех этапах фармацевтической разработки обеспечивается проведением аналитического контроля с применением надежных методов исследования.





На первых этапах биотехнологического процесса производства биофармацевтической субстанции при получении клона штаммапродуцента и его культивировании используются аналитические методы, позволяющие получить максимально возможную информацию об активном компоненте. На этапах масштабирования и переноса технологии на производственную площадку разрабатываются конкретные методы аналитического контроля показателей качества лекарственного средства.

Благодаря оценке качества активного белка на каждом этапе технологического процесса производства, возможно минимизировать затраты при идентификации несоответствия качества полупродуктов на ранних стадиях. Для этого требуется разработка современных и надежных методов оценки качества белка [1]. При разработке научно-обоснованных аналитических методов для оценки качества лекарственного средства руководствуются критериями выбора, основными из которых являются информативность, специфичность, чувствительность, точность, экспрессность, экономичность.

Вопросы контроля качества и стандартизации лекарственных средств особенно актуальны в связи с разработкой более эффективных генно-инженерных средств нового поколения [1].

Несмотря на прогресс в обеспечении безопасности и эффективности гемотрансфузионной терапии, актуальной задачей для клинической медицины остается поиск и внедрение лекарственных средств, альтернативных донорской крови, ее компонентам и препаратам [2].

Одним из таких средств является эритропоэтин (ЭПО), внедренный в клиническую практику в 1985 г [2].

ЭПО - циркулирующий в крови гликопротеидный гормон [3, 4], который стимулирует образование эритроцитов из поздних клеток-предшественников и повышает выход ретикулоцитов из костного мозга [5].

Попытки создания лекарственных препаратов на основе эндогенного ЭПО и лечение такими препаратами проводились, но широкого распространения в клинической практике они так и не получили из-за широкого спектра недостатков в сравнении с рекомбинантным аналогом. В отличие от препаратов на основе нативного белка, препараты на основе рекомбинантного белка получили более широкое распространение, что связано с меньшим риском попадания инфекций в организм человека, меньшей стоимостью препарата, а так же более широкой доступностью [6].

Рекомбинантный ЭПО широко используется для коррекции анемий при различных заболеваниях: хроническая почечная недостаточность (диализные и предиализные пациенты), онкологические заболевания (цитостатическая терапия), трансплантация органов и тканей, СПИД (терапия ВИЧ-инфекции зидовудином), аутодонорство и т.д. [2, 7-11].

ЭПО альфа и бета имеют относительно небольшой период полувыведения, что диктует необходимость вводить их до трех раз в неделю [12-14]. Закономерно, что длительное время усилия клиницистов и фармацевтов были направлены на создание препаратов нового поколения с большим периудом полувыведения, что позволило бы применять более удобные схемы их введения (1 раз в неделю, и даже 1 раз в 2 недели).

Такими препаратами стали лекарственные средства, действующим веществом которых является модифицированный ЭПО:

сверхгликозилированный (Аранесп, фирма-производитель Amgen), с присоединенным метоксиполиэтиленгликоля (Мирцера, фирма производитель Roche), а также новый препарат Азопоэтин (фирма-производитель ПетроваксФарма не распространяет информацию о модификации данного белка) и т.д.

Особый интерес для медицинского применения представляет собой сверхгликозилированный ЭПО – дарбэпоэтин альфа, поскольку он по своей структуре и действию наиболее близок к эндогенному ЭПО. Модификация ЭПО заключается в большем количестве углеводных остатков, содержащихся в структуре белка [15, 16], что при попадании в организм человека оказывает менее токсичное влияние на него в отличие от метоксиполиэтиленгликоля, который имеет свойства накапливаться в организме человека.

В настоящее время оригинальным коммерческим препаратом дарбэпоэтина является препарат Аранесп, производства фирмы Amgen, США. Существующие для рекомбинантного ЭПО единые требования к стандарту качества, описанные в Европейской фармакопее 8 выпуска, и имеющиеся доступные стандартные образцы неприменимы для дарбэпоэтина. В то же время для него отсутствуют собственные как международные, так и отраслевые нормативно-технические документы. Отсутствие стандарта качества может существенно затруднить оценку лекарственного средства при биотехнологическом производстве и привести к получению продукта ненадлежащего качества.

Кроме того, необходимо систематизировать задачи аналитического контроля по этапам создания лекарственного средства. Такая систематизация может быть проведена по принципу, по которому направление разработки схемы аналитического контроля подчиняется задачам каждого этапа фармацевтической разработки.

Также важной задачей в прикладной метрологии при биотехнологическом производстве является разработка стандартных образцов. При постадийном аналитическом контроле в процессе производства и, особенно при контроле качества готовых лекарственных средств, стандартные образцы являются незаменимым инструментом для аттестации разрабатываемых и применяемых методик анализа. Однако для дарбэпоэтина доступные стандартные образцы отсутствуют.

Таким образом, мониторинг качества наиболее важных параметров на разных стадиях биотехнологического процесса такого востребованного среди дженериков лекарственного средства как дарбэпоэтина является актуальной задачей, решение которой позволит получать безопасный и эффективный рекомбинантный продукт.

Цель и задачи работы. Целью данной работы является разработка и применение методов оценки качества дарбэпоэтина альфа в процессе биотехнологического производства.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка и характеристика методов аффинной хроматографии и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при определении концентрации дарбэпоэтина альфа в культуральной жидкости, полупродуктах и продуктах.

2. Разработка методов оценки уровня гликозилирования дарбэпоэтина на различных этапах биотехнологического процесса.

3. Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса.

3. Валидация методик оценки качества дарбэпоэтина альфа.

4. Стандартизация конечного рекомбинантного продукта в соответствии с выбранными критериями качества.

5. Разработка стандартного образца предприятия дарбэпоэтина альфа.

Научная новизна. Впервые в РФ разработан методологический подход к оценке качества готового биомедицинского продукта и полупродуктов на каждом этапе технологического процесса производства субстанции и готовой лекарственной формы (ГЛФ) дарбэпоэтина (от получения клона-продуцента до ГЛФ), включающий применение таких методов как ОФ ВЭЖХ, изоэлектрическое фокусирование с дальнейшим иммуноблоттингом, капиллярный зональный электрофорез (КЗЭ) и установление биологической активности.

Впервые показана целесообразность применения методики ОФ ВЭЖХ для количественного определения дарбэпоэтина альфа на первых стадиях технологического процесса производства, включая культивирование линии клеток продуцента.

Разработаны методики ОФ ВЭЖХ и изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом, представляющие собой инструмент для контроля качества при идентификации дарбэпоэтина на фоне сложных смесей балластных веществ.

Разработан и охарактеризован по наиболее важным параметрам (молекулярный вес белка, концентрация белка, степень гликозилирования, специфическая активность и т.д.) стандартный образец предприятия дарбэпоэтина, позволяющий осуществлять метрологическое обеспечение контроля качества биотехнологического процесса.

Научная новизна работы подтверждена патентом России № 2523948.

Разработанные методики Практическая значимость работы.

представляют собой готовый инструмент для обеспечения оценки качества на фармацевтическом производстве, проведения исследований в медицинских учреждениях, осуществления допинг-контроля, а также фундаментальных и прикладных научно-исследовательских работ.

Новые методики, разработанные для установления критических параметров дарбэпоэтина, были внесены в проект фармакопейной статьи предприятия на субстанцию и ГЛФ, а также опытно-промышленный регламент на субстанцию (№ 56882590-17-12) и на ГЛФ (№ 56882590-18-13) ООО «Фармапарк».

Работа выполнена в рамках государственного контракта Министерства образования и науки РФ № 16.522.12.2008 в 2011-2013 гг. на базе отдела медицинской биотехнологии ФГУП «ГосНИИгенетика».

Разработка методик оценки качества Личный вклад соискателя.

дарбэпоэтина на каждом технологическом этапе производственного процесса получения биофармацевтического продукта проводилась совместно с к.б.н.

Мосиной А.Г., к.б.н. Стародубцевой Л.И., а также с лабораторий иммунологии ФГУП ГосНИИгенетика под руководством к.б.н. Юрина В.Л., за что им выражается глубокая благодарность. Автором проведены обоснование методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина, валидация разработанных методик, разработка спецификации на субстанцию и ГЛФ рекомбинантного дарбэпоэтина, вошедшая в проект фармакопейной статьи предприятия, а также разработка нормативно-технической документации на стандартный образец предприятия.

Результаты диссертационной работы Апробация результатов.

представлены и обсуждены на международном симпозиуме «Биофарма – 2013: от науки к промышленности» (Будва, 2013), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика» и сотрудников ООО «Фармапарк»

(Москва, 2014).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 7 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК (Биотехнология, Биофармацевтический журнал).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 99 источник, из них 70 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 23 таблицы, 38 рисунков и 9 страниц приложений.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная схема мониторинга качества дарбэпоэтина на всех этапах технологического процесса производства субстанции дарбэпоэтина (включающая изоэлектрическое фокусирование, КЗЭ, ОФ ВЭЖХ и определение биологической активности) обеспечивает получение продукта надлежащего качества.

2. Обоснованные параметры стандартизации дарбэпоэтина (степень гликозилирования, концентрация и биологическая активность) позволяют специфицировать его в соответствии с международными требованиями к биофармацевтическим генно-инженерным продуктам.

3. Установленные критерии валидации (специфичность, линейность, правильность, прецизионность, предел количественного определения (ПКО), диапазон применения, робастность) аналитических методик оценки качества образцов дарбэпоэтина обеспечивают надлежащий производственный контроль на всех этапах технологического процесса производства лекарственного средства.

4. Обоснованные показатели качества стандартного образца дарбэпоэтина, включающие подтверждение подлинности с помощью КЗЭ, изоэлектрического фокусирования с иммуноблоттингом, масс-спектрометрии, установление биологической активности in vivo, а также определения степени сиалирования, позволяют использовать его для подтверждения соответствия производственных серий субстанции дарбэпоэтина установленным требованиям.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Влияние степени гликозилирования на биологическую активность белка Гликолизилирование является одной из наиболее важных посттрансляционных модификаций, определяющих структуру и функции большинства белков плазмы человека, в том числе ЭПО [17]. Высокий уровень гликозилирования обеспечивает эффективность его гемопоэтической активности in vivo [18, 19]. В то же время аффинность взаимодействия ЭПО с рецепторами на поверхности клеток-предшественников эритроидного ряда и стимуляция их дифференцировки полностью определяется только полипептидным каркасом молекулы ЭПО. Уровень гликозилирования ЭПО непосредственно влияет на скорость элиминации биологически активного белка из организма и на длительность его гемопоэтического действия, которая, тем не менее, остается крайне непродолжительной для эффективного терапевтического использования гормона при анемиях различного генеза [15, 20].

Кроме того ЭПО, как и другие гликопротеины плазмы, быстро подвергается энзиматической деградации, лишаясь сиаловых кислот, что приводит к короткому времени циркуляции в организме и необходимости частого введения белка для достижения максимального клинического эффекта [21-24]. Известно несколько стратегий повышения стабильности ЭПО in vivo, обусловленных двумя механизмами элиминации (выведения) ЭПО из организма. Это увеличение размеров молекулы ЭПО за счет генно-инженерного введения дополнительных лигандов, что приводит к снижению почечного клиренса [14, 25]. Возможно также введение в молекулу ЭПО дополнительных углеводных цепей, что приводит к увеличению количества сиаловых групп и снижению уровня элиминации ЭПО через экспрессируемые на клетках печени рецепторы для асиалированных белков - ASGR [26].

Один из аспектов гликоинженеринга – это введение N-связанных гликозилированных последовательностей в желаемую позицию в пептидной последовательности, чтобы произвести белок с большим количеством сиаловых кислот в углеводном остатке, увеличивая тем самым биологическую активность [16].

Как показано при создании коммерческого препарата на основе модифицированного ЭПО «Aranesp» компании Amgen, введение в молекулу ЭПО двух дополнительных сайтов N-гликозилирования увеличивает время выведения гормона из организма в 3-4 раза [27-30]. Для получения дарбэпоэтина альфа использована технология генетической модификации белковой структуры ЭПО.

Молекула модифицированного ЭПО (дарбэпоэтин альфа) содержит 5 замен в аминокислотной последовательности, две из которых являются дополнительными сайтами N-гликозилирования. Высокая степень гликозилирования обеспечивает дарбэпоэтину пролонгированную биологическую активность и клинический эффект даже при сниженной в два раза, по сравнению с ЭПО, способности к аффинному взаимодействию со специфическим рецептором [22, 31].

1.2. Особенности структуры, физических и биологических свойств эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина Рекомбинантные ЭПО первого поколения, ЭПО альфа и бета, по своей химической структуре идентичны нативному ЭПО и представляют собой гликопротеин с молекулярной массой 30,4 кДа. В структуре молекулы ЭПО выделяют единую полипептидную цепочку из 165 аминокислот, имеющую в своем составе 2 дисульфидных мостика и четыре сайта гликозилирования (Рисунок 1) [14, 32, 33]. Молекула ЭПО имеет четыре карбогидратных цепи, три из которых связаны с пептидной цепью через азот аспарагина (Nгликозилирование), а одна – через кислород серина (O-гликозилирование). При этом гликолизильные цепи составляют около 40% от молекулярного веса молекулы [16, 22, 34, 35]. Каждая из трех N-углеводных цепей (Asn 24, 38 и 83) состоит из 2 - 4 ветвей. Для O-углеводных цепей (Ser 126) характерно наличие 1 ветвей. Углеводная цепь может завершаться остатком сиаловой кислоты. Таким образом, максимальное количество сиаловых кислот в молекуле ЭПО равно 14, что придает всей молекуле ЭПО отрицательный заряд, лишает ее возможности связаться с ASGR-рецепторами гепатоцитов и, соответственно, увеличивает время циркуляции в организме [26].

Рисунок 1. Структура рекомбинантного эритропоэтина

Известно, что в результате посттрансляционных модификаций образуется смесь различных изоформ, определяемых по числу свободных сиаловых остатков.

N-связанные боковые углеводные цепи предсинтезируются различными энзимами и являются доступными для посттрансляционного добавления к полипептиду ЭПО. Каждая изоформа обладает собственной биоактивностью. Наибольшей эритропоэтической активностью обладает изоформа 14 [14, 36, 37]. С другой стороны, изоформы с меньшим числом остатков сиаловой кислоты имеют большее сродство к рецептору ЭПО, но более короткий период циркуляции.

Очищенные коммерческие препараты ЭПО альфа и бета состоят из смеси изоформ от 9 до 14 (Рисунок 2) [36].

Рисунок 2. Изоформы эритропоэтина разной степени сиалирования [22] Как уже было сказано выше для замедления скорости выведения ЭПО и повышение его активности был применен новый подход – гликоинженеринг [16].

В результате была создана принципиально новая молекула дарбэпоэтина альфа с массой до 37,1 кДа, имеющая 5 участков гликозилирования, а число свободных сиаловых групп доведено до 22 (Рисунок 3) [15, 22, 29, 38].

Рисунок 3. Сравнение структуры молекулы рекомбинантного человеческого ЭПО (А) и дарбэпоэтина альфа (Б) [15] Аминокислотная последовательность дарбэпоэтина отличается от таковой у человеческого ЭПО в 5 положениях, что и позволило осуществить присоединение дополнительных ветвей углеводов к аспарагиновым остаткам в положениях 30 и 88 без разрушения общей конформации молекулы (Рисунок 4).

Таким образом, дарбэпоэтин отличается от ЭПО высоким содержанием углеводов и сиаловых остатков, более высокой молекулярной массой и увеличенным отрицательным зарядом [39].

–  –  –

Таблица наглядно демонстрирует возможность большего пребывания дарбэпоэтина в организме человека относительно ЭПО альфа и бета, что, в свою очередь, приводит к уменьшению частоты введения.

1.3. Дженерики и проблемы воспроизведенных лекарственных препаратов Доля воспроизведенных лекарственных препаратов на современном фармацевтическом рынке по разным данным составляет от 77% до 88-95% [49В соответствии с определением понятия «воспроизведенный препарат», представленном в действующем Федеральном законе РФ, обязательным условием эквивалентности состава воспроизведенного лекарственного препарата оригинальному является идентичность фармацевтической субстанции и лекарственной формы [52]. Согласно определению Директивы ЕС, воспроизведенный медицинский продукт (generic medical product) – продукт, который имеет тот же, что и препарат сравнения качественный и количественный состав действующих веществ (active substances) и лекарственную форму, биологические свойства которых подтверждены в исследованиях биоэквивалентности [53]. Для взаимозаменяемых продуктов должна быть представлена дополнительная информация, подтверждающая их терапевтическую эквивалентность и отсутствие отличий по профилю безопасности воспроизведенного препарата (generic) и препарата сравнения [54].

Необходимо отметить, что для иммунобиологических препаратов при установлении их химической эквивалентности необходимо учитывать сложный состав биофармацевтических продуктов, зависимость профиля безопасности от уникальности производственного процесса, определяющего чистоту продукта, конформацию белка, степень гликозилирования [55].

Основными этапами исследований безопасности и эффективности лекарственных средств в настоящее время являются дорегистрационный (доклинические, клинические исследования) и пострегистрационные этапы.

Каждый этап чрезвычайно важен для решения вопроса о возможности продолжения исследований лекарственного препарата и применения его в медицинской практике, однако каждый этап имеет свои особенности и ограничения в оценке безопасности [49].

Таким образом, оценка качества, как конечного продукта, так и полупродуктов на каждом этапе технологического процесса производства лекарственного средства является одной из первых и важных стадий подтверждения эффективности и безопасности воспроизводимого препарата.

Данную работу можно рассматривать как часть разработки дорегистрационного этапа проверки эффективности и безопасности с помощью ряда физико-химических и биологических методик для лекарственного средства дарбэпоэтина альфа.

–  –  –

Получение ГЛФ – процесс весьма длительный, проходящий в несколько этапов, таких как получение и культивирование клона продуцента, выделение целевого белка из культуральной жидкости с помощью различных хроматографических методов биотехнологической очистки белка (здесь, как правило, несколько стадий), приготовление субстанции. Из чего следует, что в конце каждого этапа имеется полупродукт, который необходимо охарактеризовать. Таким образом, на каждом этапе следует осуществлять оценку качества полученного белка, который в дальнейшем передается на следующий этап.

Первая стадия – это получение клона продуцента и его культивирование. На данном этапе имеется сложная смесь - культуральная жидкость, которая включает в свой состав огромное количество различных компонентов (целевой белок, клетки, продукты жизнедеятельности клеток, не целевые белки, агрегаты белков, продукты деградации белков и т.д.) [56]. Охарактеризовать целевой белок в такой смеси достаточно сложная проблема. Однако на данном этапе оценка белка по всем параметрам не требуется. Необходимо установить наиболее важные параметры белка, несоответствие которых установленным спецификациям может привести в дальнейшем к получению продукта ненадлежащего качества. В случае с дарбэпоэтином основным параметром является наличие высокосиалированных форм белка и концентрация целевого белка в культуральной жидкости. Контроль концентрации белка позволяет говорить о качестве проведенного процесса культивирования, при этом высокая концентрация белка еще не говорит о качественном процессе культивирования, поскольку в полученной смеси должны присутствовать высокосиалированные форм белка, поскольку именно они и определяют дальнейшую эффективность лекарственного средства [57-60].

Таким образом, для дальнейшего биотехнологического выделения целевого белка из культуральной жидкости необходимо установить минимум информации, а именно количество белка в культуральной жидкости и его изоформенный состав [57].

После стадии культивирования линии клеток продуцента культуральная жидкость, содержащая целевой белок, передается на стадию биотехнологического выделения белка, где в несколько этапов происходит очистка дарбэпоэтина от компонентов, присутствующих в культуральной жидкости и не представляющих никакой ценности для дальнейшего биомедицинского препарата [57].

Культуральная жидкость представляет собой смесь большого количества белков, липидов, протеаз и других биологических соединений, тогда как концентрация целевого белка в среде невысока [57]. Существует большое количество способов выделения белков, одним из самых популярных методов для выделения целевого белка из культуральной жидкости является аффинная хроматография, которая достаточно широко применялась при выделении близкого родственника дарбэпоэтина – ЭПО [61]. Поскольку принцип метода основан на специфическим взаимодействии белка с антителами к данному белку, то выделение белка проходило с достаточно высокой эффективностью. В аффинной хроматографии в основном применялись мышиные моноклональные антитела к ЭПО. Однако в дальнейшую технологическую схему приходиться вносить большое количество дополнительных этапов очистки полученного раствора белка от моноклональных антител, поскольку попадание таких антител с лекарственным средством в организм человека может привести к серьезным проблемам со здоровьем [62-64]. В связи с этим в последнее время проводилось большое количество разработок технологического процесса без такого затратного шага, как аффинная хроматография.

Итак, с учетом сложного состава культуральной жидкости, была введена стадия предподготовки сырья. Вследствие чего, сначала культуральную жидкость концентрируют с использованием мембран для тангенциальной фильтрации до небольшого объема, а затем проводят процесс диафильтрации против диализного буферного раствора (уравновешивающий буфер для первой стадии хроматографической очистки). Этот шаг позволяет не только избавиться от большого количества примесей, присутствующих в культуральной жидкости, от компонентов питательной среды, но и сразу подготовить сырье для передачи его на первую стадию очистки. Еще один немаловажный момент заключается в том, что величина концентрации белка в исходном сырье становится, таким образом, высокой, что облегчает задачу детекции белка во всех хроматографических фракциях [31, 56, 57, 65].

Следующий технологический модуль представляет собой ионообменную хроматографию, который позволяет отделить щелочные изоформы дарбэпоэтина, и очиститься от компонентов питательной среды, что, в свою очередь, достигается путем промывания носителя с сорбированным на нем белком буфером, содержащим 6М мочевину и низким значением рН 3,1. Варьирование значения рН позволяет отсекать различное количество щелочных изоформ.

Экспериментальным путем было установлено, что значение рН равное 3,1 позволяет получить профиль гликозилирования, соответствующий оригинальному препарату «Аранесп». Целевой белок элюируется ступенькой буфером с более высокой ионной силой. Этот шаг является одним из самых важных во всей технологической схеме, поскольку именно на данном этапе выделяют целевой белок именно с тем профилем гликозилирования, с которым в дальнейшем будет выпущено лекарственное средство. В связи с этим на данном этапе необходимо контролировать изоформенный состав полученного элюата и концентрацию целевого белка [31, 57, 65].

Далее полученный элюат раствора дарбэпоэтина наносится на следующую колонку, упакованную CM-Sepharose, производитель GE Healthcare. В данном случае используются такие условия посадки, при которых целевой белок остается во фракции, не связанной с колонкой, а примесные белки и ДНК сорбируются на носителе. На этой стадии удаляются примесные белки и ДНК, в результате чего достигается достаточно высокая степень чистоты белка [31, 57, 65].

После CM-Sepharose белок находится в разбавленном состоянии и может содержать остаточные примесные белки близкие по физико-химическим свойствам. Чтобы добиться высокой степени чистоты дарбэпоэтина, повторно использют ионообменный сорбент. Но в данном случае белок элюируется с колонки солевым градиентом небольшими фракциями, который позволяет разделить белки, схожие по своим свойствам. Также данный шаг позволяет сконцентрировать целевой белок. В результате объединяются фракции, содержащие дарбэпоэтин не менее 97 % чистоты [31, 57, 65].

Эти два шага направлены на получение исключительно чистого раствора белка, следовательно, описанные действия не должны оказывать большого влияния ни на концентрацию целевого белка, ни на его изоформеннй состав.

Таким образом, контроль качества по наиболее важным параметрам (изоформенный состав и концентрация целевого белка) проводится после первой стадии хроматографического выделения, на последующих хроматографических стадиях проводится только контроль чистоты полученного элюата [57].

По завершению биотехнологического выделения белка из полученного полупродукта получают субстанцию. Здесь также важна концентрация дарбэпоэтина, его изоформенный состав, который и будет в дальнейшем определять биологическую активность лекарственного препарата, подтверждающим тестом является тест по установлению биологической активности на нормоцитемических мышах.

1.5. Методы оценки качетва дарбэпоэтина альфа

Как уже говорилось выше, рекомбинантному человеческому ЭПО в Европейской Фармакопее посвящен целый раздел, в котором подробно описаны методы его контроля и спецификации на данный белок [32]. В свою очередь рекомбинантный дарбэпоэтин не имеет такого раздела в Европейской Фармакопее, что требует разработки нового методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина альфа.

Основной характеристикой лекарственного средства на основе дарбэпоэтина является степень гликозилирования белка и его изоформенный состав, который определяет его биологическую активность [14, 16, 26-30, 36, 37].

Основными методиками, позволяющими идентифицировать изоформы белка, являются КЗЭ и изоэлектрическое фокусирование [32]. Однако возможность применения того или иного метода может быть ограничена. Для выбора подходящих методик оценки качества белка в первую очередь руководствуются такими критериями, как стоимость, техническое оснащение лаборатории, трудоемкость, возможности самой методики, а также время, потраченное на анализ. В дальнейшем нами будут рассмотрены обе методики относительно возможности их применения к дарбэпоэтину.

Для установления биологической активности лекарственного средства существует ряд методов как in vitro, так и in vivo [32]. Что касается модифицированного аналога ЭПО, то в литературе описаны преимущественно попытки установления его активности на мышах. Однако единого мнения относительно биологической активности пролонгированного аналога ЭПО не существует [12, 22, 28, 29, 47, 66-70].

Но перед тем как проводить все указанные выше эксперименты необходимо установить количество дарбэпоэтина в растворе. В современной биотехнологии существует большое количество методов установления количественного содержания того или иного белка. Для ЭПО в Европейской Фармакопее описан спектрофотометрический метод [32]. Данный метод имеет существенный недостаток, он применим исключительно к чистым растворам, таким как субстанция или ГЛФ. Но так как в дальнейшем наша задача не ограничивается контролем качества готового препарата, то перед нами стояла задача подобрать метод с такими возможностями, который позволит не только идентифицировать белок в такой сложной смеси, как культуральная жидкость, но и установить его количество. В современной науке для достижения таких целей достаточно давно используются различные виды хроматографирования [71, 72]. Но в литературе нет описания хроматографического метода для его применения к дарбэпоэтину для определения его количественного содержания в культуральной жидкости, полупродуктах и продуктах.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является эффективным методом аналитического контроля и экспертизы [73].

Хроматографические методы наиболее широко используемый вид анализа, применяемый при разработке и контроле качества лекарственных препаратов [74].

Среди различных вариантов хроматографического анализа очень широкое применение в последние десятилетия получила жидкостная хроматография, в первую очередь благодаря возможности анализа сложных смесей биообъектов, таких как белки, нуклеиновые кислоты, антиоксиданты, ферменты и т.д. [73] Одним из наиболее распространённых в биотехнологии вариантов ВЭЖХ является ОФ ВЭЖХ, при которой неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная, именно поэтому в состав подвижной фазы практически всегда входит вода [75].

ОФ ВЭЖХ имеет ряд преимуществ перед другими вариантами жидкостной хроматографии:

– это очень гибкий метод, так как изменяя состав водно-органических смесей, используемых в качестве подвижной фазы, можно на одной колонке обеспечить разделение соединений различной природы;

– селективность данного метода почти всегда значительно выше, чем при использовании других вариантов хроматографии для всех соединений, кроме сильно полярных;

– при использовании гидрофобизированных силикагелей быстро устанавливается равновесие между подвижной и неподвижной фазой, эти сорбенты отличаются высокой эффективностью разделения;

– можно осуществлять разделение соединений, растворимых как в воде, так и в органических растворителях;

– возможность использования в подвижной фазе буферных растворов может улучшить селективность и эффективность разделения ионогенных соединений [76].

Метод ОФ ВЭЖХ успешно применяется относительно дарбэпоэтина при идентификации примесей, сиаловых групп и при пептидном картировании [56, 77]. Однако данный метод не описан для его использования при количественном определении дарбэпоэтина.

При разработке метода ОФ ВЭЖХ необходимо учитывать ряд факторов, которые определяют удерживание различных сорбатов:

– гидрофобностью сорбатов;

– дипольный момент;

– объем молекул;

– поляризуемость;

– уменьшение площади неполярной поверхности при сорбции [76].

Для решения каждой конкретной задачи состав как подвижной, так и неподвижной фазы должен быть тщательно подобран с точки зрения как физических, так и химических свойств ее компонентов [76].

1.6. Валидация аналитических методик в процессе биотехнологического производства лекарственных средств

Валидации подвергаются аналитические методы, применяемые для:

идентификации лекарственного вещества; установления пределов содержания примесей родственных соединений, тяжелых металлов, остаточных органических растворителей; количественного определения лекарственного вещества, лекарственного вещества (веществ) в составе лекарственных форм, индивидуальных примесей, суммы примесных продуктов, консервантов.

Результаты валидации документируются для подтверждения пригодности методики для контроля качества лекарственных препаратов. Валидация должна сопровождать любое предложение нового или модификация существующего аналитического метода [78].

Все аналитические методики и испытания, включенные в нормативные документы, должны быть валидированы [78].

Валидация - это документированное доказательство того, что процедура, процесс, действие, субстанция, оборудование или система дает ожидаемый результат. Это компонент подтверждения качества продукта, системы или процедуры, а также это неотъемлемая часть Надлежащей производственной практики (GMP). Каждый основной шаг производственного процесса должен быть валидирован для увеличения уверенности в том, что финальный продукт будет получен надлежащего качества [79].

Все аналитические методики, используемые при контроле качества лекарственного средства, делятся на 4 категории: испытание на идентификацию (подлинность), количественные испытания для определения примесей, испытания на предельное содержание для контроля примесей, испытания для количественного определения действующего вещества в образцах активной субстанции или готового лекарственного препарата, а также для количественного определения других компонентов лекарственного препарата (например, консервантов) [78, 80].

Испытания на идентификацию предназначены для подтверждения подлинности анализируемого вещества в образце. Обычно это достигается путем сравнения каких-либо свойств (например, спектральных характеристик, хроматографического поведения, химической реакционной способности и т. д.) испытуемого и стандартного образцов [78, 80].

Испытания, предназначенные для контроля примесей, могут быть как количественными, так и предельными. Назначение обоих испытаний — характеризовать чистоту образца. Для валидации количественных и предельных испытаний необходимы различные валидационные характеристики [78, 80].

Количественное определение предназначено для определения количества анализируемого вещества в образце. При валидации методик количественного определения действующих веществ и других компонентов лекарственного препарата применяют одинаковые валидационные характеристики. Такие же валидационные характеристики могут быть применимы к методике количественного определения, связанной с другим испытанием (например, «Растворение») [78, 80].

От типа методики зависят параметры, которые необходимо установить при валидации. В таблице 2 приведены основные параметры валидации аналитических методик.

Также следует учитывать, что на стадии разработки методики необходимо проводить установление такой валидационной характеристики, как робастность [78, 80].

–  –  –

Ниже приведены определения валидационных характеристик.

Правильность Trueness) (Accuracy или аналитической методики характеризует близость результатов испытаний, полученных данной методикой, к истинному значению. Показателем правильности методики обычно является значение систематической погрешности (bias, systematic error). Систематическая погрешность выражается как разность между математическим ожиданием результатов измерений и истинным (или в его отсутствии – принятым опорным – accepted reference value) значением [78, 80-83].

При количественном определении лекарственного вещества этот параметр может быть установлен путем применения аналитической методики к анализируемому объекту с использованием стандарта известной степени чистоты или путем сравнения результатов, полученных предлагаемой аналитической методикой, с результатами, которые получены другой независимой методикой, правильность которой известна. Также заключение о правильности можно сделать после установления прецизионности, линейности и специфичности. В случае количественного определения вещества в лекарственной форме правильность аналитической методики устанавливается по результатам ее применения к анализу модельной смеси, включающей все компоненты лекарственной формы и известное количество определяемого вещества [78, 80].

Правильность метода количественного определения идентифицированных примесных соединений устанавливается по результатам анализа методом добавок. При отсутствии образцов примесных соединений или в тех случаях, когда структура их не установлена, правильность предлагаемой методики их определения должна быть подтверждена результатами анализа другой аналитической методикой с охарактеризованной правильностью [78, 80].

Правильность оценивается на основе не менее 9 результатов определений на минимум 3 уровнях концентраций в пределе аналитической области (например, 3 повторности определения для 3 аналитических концентраций) [78, 80].

Правильность выражают в процентах найденного значения от введенного количества или как разность между средним и истинным значением с учетом соответствующих доверительных интервалов [78, 80].

Прецизионность (Precision) аналитической методики характеризует степень близости независимых результатов индивидуальных испытаний, полученных в конкретных установленных условиях. Эта характеристика зависит только от случайных факторов и не связана с истинным значением измеряемой величины. Она выражается величиной стандартного отклонения – коэффициентом вариации. Прецизионность следует рассматривать на трех уровнях – повторяемость (сходимость), промежуточная прецизионность и воспроизводимость [78, 80-83].

Повторяемость (сходимость) (Repeatability) характеризует степень близости результатов измерений (испытаний), полученных одной и той же методикой на идентичных объектах испытаний, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования, в пределах короткого промежутка времени; критерием является стандартное отклонение параллельных определений [78, 80-83].

Промежуточная прецизионность (intermediateprecision) выражает внутрилабораторные отклонения: разные дни, разные операторы, разное оборудование и т.д. [78, 80-83].

Воспроизводимость (Reproducibility) характеризует степень близости количественных результатов измерений, полученных одной и той же методикой, на идентичных образцах, в разных лабораториях, разными операторами, с использованием различного оборудования. Также оценивается по стандартному отклонению параллельных определений.

Обратным понятию воспроизводимости является понятие вариабельности измерений, являющейся мерой различия их результатов [78, 80-83].

Прецизионность аналитической методики устанавливается по результатам определений такого количества аликвот однородного образца, которое позволяет рассчитать величину стандартного отклонения или относительного стандартного отклонения (коэффициент вариации). ICH рекомендует оценивать прецизионность по результатам определения не менее 9 аликвот образца (3 концентрации в 3 повторностях) или не менее 6 определений при анализе 100% концентрации, которые позволят статистически рассчитать эти параметры [78, 80].

Термин «точность (аccuracy)» применительно к серии измерений включает сочетание 2 составляющих: «правильность» и «прецизионность» (Рисунок 5).

Рисунок 5. Структура термина «точность» [78, 80]

Специфичность, Selectivity) селективность (Specifity, иногда – аналитической методики определяется её способностью достоверно определять лекарственное вещество в присутствии примесных соединений, продуктов деградации и вспомогательных веществ [78, 80-83].

Линейность (Linearity) устанавливается на основании результатов испытаний, которые пропорциональны концентрации анализируемого вещества в образце в пределах аналитической методики. Линейность результатов может быть представлена графически в виде зависимости аналитических сигналов от концентрации вещества (не менее 5) [78, 80-83].

Для подтверждения линейности аналитической методики используются следующие параметры: коэффициент регрессии, угол наклона линии регрессии и остаточная сумма площадей [78, 80-83].

Аналитическая область, в пределах которой соблюдается линейная зависимость, охватывает интервал между верхним и нижним пределами анализируемого вещества (включая эти пределы), в интервале которых данная методика обеспечивает его определение с требуемыми прецизионностью и правильностью. Аналитическая область обычно выражается в тех же единицах, что и результаты испытаний, полученные с помощью данной методики [78, 80].

ICH рекомендует использовать для установления линейной зависимости не менее 5 концентраций анализируемого вещества с учетом следующих оптимальных областей:

- для количественного содержания анализируемого вещества в образце или лекарственной форме – 80 – 120% от определяемой величины;

- для показателя «Однородность дозирования по содержанию» – 70–130% от определяемой величины; или более широкий интервал в соответствии с природой дозированной формы (например, дозированный ингалятор);

- для показателя «Растворение» – ±20% от предела, регламентированного НД (например, если для таблеток с контролируемым высвобождением нормируется предел от 20% – через 1 ч и до 90% – через 24 ч, то валидированная аналитическая область должна охватывать интервал 0 – 110% от регламентируемых норм);

- для содержания примесных продуктов – 50–120% от нормируемых пределов [80].

Предел обнаружения (Limit of detection) – характеризует методики, предназначенные для лимитирующих тестов; выражается минимальным содержанием анализируемого вещества в образце, которое может быть обнаружено данным методом, но не определено количественно в условиях анализа. Эта величина выявляет способность аналитической методики определять концентрации вещества выше и ниже требуемого уровня.

Предел обнаружения обычно выражается как концентрация анализируемого вещества (например, в % или долях на миллион – ppm) в образце и используется главным образом для испытаний на чистоту [78, 80-83].

Предел количественного определения (ПКО) (Limit of quantitation) – это минимальное количество анализируемого вещества, которое может быть определено с приемлемой точностью в условиях анализа. Это характеристика методик количественного определения малых концентраций веществ в образце (например, примесей или продуктов деградации в лекарственном веществе). Предел количественного определения выражается как концентрация анализируемого вещества в образце [78, 80Для инструментальных методов, характеризующихся фоновыми помехами, документы ICH рекомендуют сравнивать сигналы образцов с известной минимальной концентрацией вещества с сигналами от контрольных проб.

Устанавливается минимальная концентрация, при которой определяемое вещество достоверно может быть определено количественно. Допустимое отношение «сигнал/помеха» 10:1 [78, 80].

Аналитическая область методики (Range) – интервал данной аналитической методики, который обеспечивает точность, правильность и линейность при определении образцов, содержащих аналит на границах интервала и внутри него. Определяется в ходе проведения испытаний по каждому из перечисленных параметров [78, 80-83].

Робастность (Robustness) – степень влияния отдельных параметров методики на результаты анализа. Способность аналитической методики не реагировать на небольшие изменения параметров методики оценивается путем варьирования таких показателей, как процентное содержание органических веществ, рН, ионная сила, температура и определение степени их влияния на полученные результаты. Согласно рекомендациям ICH, прочность метода должна учитываться на стадии разработки методики.

Если такое влияние установлено, то в дальнейшем соответствующие параметры методики должны строго контролироваться и документироваться [78, 80-83].

Пригодность системы (System suitability) — интегральная часть многих аналитических методик, которая показывает надежность анализа в заданных условиях его проведения. Параметры пригодности системы обеспечивают соблюдение валидности метода в тех случаях, когда в процессе анализа возможны некоторые внутрилабораторные изменения условий анализа [78, 80].

Таким образом, фармакопейный анализ складывается из совокупности аналитических методик, изложенных в фармакопее и используемых для:

подтверждения подлинности исследуемого лекарственного средства; определения примесей и продуктов деградации; количественного определения лекарственного вещества или ингредиентов лекарственных форм. Каждая методика, применяемая для стандартизации лекарственных средств, требует различных схем валидации.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования, проведенные в рамках диссертационной работы, финансировались из средств государственного контракта Министерства образования и науки РФ № 16.522.12.2008 «Разработка технологии получения гипергликозилированного белка для стимулирования эритропоэза - дарбэпоэтина альфа». Основная часть работ выполнена в период с 2011 по 2013 гг. на базе отдела медицинской биотехнологии Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линия клеток продуцента, полупродукты и продукты дарбэпоэтина.

Линия продуцента дарбэпоэтина альфа получена сотрудниками отдела медицинской биотехнологии ГосНИИгенетика путем трансформации клеток яичника китайского хомяка СНО-S экспрессионной плазмидой рCI-dEPO2x, содержащей ген целевого белка [57]. Линия продуцента дарбэпоэтина представляет собой высокопродуктивный клон трансфецированных экспрессионной плазмидой клеток СНО-S, продуцирующий не менее 50 мкг/мл дарбэпоэтина альфа с высокосиалированными формами белка.

Продукты и полупродукты дарбэпоэтина были получены сотрудниками отдела медицинской биотехнологии ГосНИИгенетика в несколько этапов:

концентрирование и диафильтрация культуральной жидкости на мембранах, анионообменная хроматография, катионообменная хроматография, концентрирование конечного продукта, гель-фильтрация.

Электрофорез в Электрофорез в полиакриламидном геле.

полиакриламидном геле (ПААГ) в невосстанавливающих условиях был проведен в стандартном исполнении в модификации Лэммли [84]. Для анализа использовались 12% разделяющий гель и 5% концентрирующий гель. Перед нанесением образцов на гель проводилась их пробоподготовка, путем разведения в 2 раза буфером для разведения образцов (0,05M трис-гидрохлорида, содержащего 2% додецилсульфата натрия, 0,1М дитиотреитола, 0,1% бромфенолового синего, 10% глицирина, рН=6,8), после чего образцы были прогреты при 100°С в течении 5 минут в термостате Eppendorf, Германия. На гель образцы наносились в объеме – 10 мкл.

Разделение проходило под напряжением 200 В в течение 50 мин в электрофорезной камере Bio-Rad, США. Гели окрашивались раствором серебра по следующей схеме: инкубация гелей в растворе уксусной кислоты и 40% этиловом спирте, затем инкубация в 10 % этиловом спирте, после гели промывались водой, далее инкубация в серебряно-нитратном реактиве, после чего опять проводилась промывка гелей водой. Проявление полос проходило в растворе 0,01% лимонной кислоты и 0,05% формальдегида, реакцию окрашивания останавливали раствором 10% уксусной кислоты.

Все пробы перед анализом Изоэлектрическое фокусирование.

предварительно были обессолены и сконцентрированы до 0,03 мг/мл, после чего они были переведены в 7,3М раствор мочевины. Готовые образцы были нанесены в объеме 10 мкл на гель.

Изоэлектрическое фокусирование осуществляли в геле с градиентом рН от 2 до 10 с помощью системы GE Healthcare (Multiphor II, MultiTemp IV, EPS 3501 XL), США. В ходе анализа использовались следующие режимы: предфокусировка при напряжении 100 В, силе тока 24 мA и мощности 20 Вт в течение 45 минут;

вхождение белков в гель при напряжении 500 В, силе тока 24 мA и мощности 20 Вт в течение 30 минут и разделение при напряжении 1500 В, силе тока 24 мА и мощности 20 Вт в течение 60 минут. Для заливки геля использовали амфолиты Pharmalyte 3-10 (GE Healthcare, CША) и Servalyt 2-4 (Serva, Германия). После проведения разделения белков гель отделяют от подложки после его инкубирования в растворе, содержащем 1% Tween-20, 0,05М трис(гидроксиметил)аминометана, 0,04М глицина, 0,4% додецилсульфата натрия, 20% этилового спирта. После делается «сэндвич» из геля и мембраны PVDF и осуществляется электроперенос, как это описано в разделе ниже.

Иммуноблоттинг. Процедура иммуноблоттинга проходит в несколько стадий. Первая стадия – разделение белков в геле с помощью электрофореза или изоэлектрического фокусирования, как это было описано выше. Далее проводился перенос белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану в течении 45 минут при напряжении 15 В с помощью прибора для полусухого переноса BIO-RAD, США.

После переноса белка, мембрану инкубировали в блокирующем растворе (2,5% раствор альбумина бычьего сывороточного) при температуре 2-8 °С. Затем мембрана была помещена в емкость с раствором первичных антител (антитела мыши к ЭПО человека (Мab 2871, R&D System), в концентрации 1 мкг/мл) и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. После трехкратной отмывки буферным раствором (0,2 М трис-гидрохлорида, содержащего 1,5 М натрия хлорида и 0,05% Tween-20), мембрана была помещена в емкость со вторичными антителами (Антитела, специфичные к IgG мыши, конъюгированные с щелочной фосфатазой (А3562, Sigma-Aldrich), разведение 1/30000) и также инкубировалась в течение часа при комнатной температуре. Далее мембрана была помещена в емкость с субстратом BCIP/NBT (Sigma-Aldrich, № В5655), где она инкубировалась при комнатной температуре при постоянном перемешивании до четкого проявления полос. Реакция окраски останавливалась промывкой мембраны водой очищенной.

Капиллярный зональный электрофорез. Все образцы при проведении КЗЭ были обессолены и сконцентрированы или разведены до концентрации 1 мг/мл на центрифуге Eppendorf, Германия.

Разделение проводилось на приборе фирмы Beckman, США с установленным в нем кварцевым капилляром общей длиной 109 см, эффективной длиной – 100 см. Перед началом анализа капилляр был промыт водой очищенной в течении 5 минут, затем 0,1М раствором натрия гидроксида в течение 15 минут и сново водой очищенной в течении 5 минут, далее буфером для капиллярного электрофореза (0,01М NaCl, 0,01M трицин, 0,01М СH3COONa·3H2O, 7М мочевина, 0,0025М путресцин дигидрохлорид, рН = 4,5 или 5,5) в течение 10 минут. Ввод пробы осуществлялся под давлением 30 мбар в течение 20 секунд.

Анализ проводился при температуре капилляра 35 °C и напряжении 25 кВ, детекция осуществлялась с помощью УФ-детектора при длине волны 214 нм Аффинная хроматография. Хроматографию проводили на системе UltiMate 3000 фирмы Dionex, США с использованием колонки Tricorn 5/20 фирмы (GE Healthcare, США) с общим объемом сорбента 300 мкл. В качестве лигандов были использованы моноклональные антитела к ЭПО, полученные в лаборатории иммунологии ФГУП ГосНИИгенетики. Объем вводимой пробы дарбэпоэтина альфа составлял 25 мкл с концентрацией, не превышающей 20 мкг/мл. Образцы культуральной жидкости были предварительно откручены на центирифуге при 10000 об/мин в течение 3 минут.

Перед началом анализа колонку уравновешивали подвижной фазой А (150 мМ NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 7.4), при скорости потока 0,2 мл/мин. Ступенчатую подачу элюентов осуществляли по следующей схеме: 0-7 мин элюент А (150 мМ NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 7.4), 7-12 мин элюент B (3М NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 2.0), 12-17 мин элюент С (2М глицин, рН 2.0). Скорость потока составляла 0,2 мл/мин. Температура автосамплера составляла 4,0±0,1 С.

Элюирующиеся с колонки вещества детектировали с помощью флюориметрического детектора при длине волны поглощения 270 нм и длине волны эмиссии 340 нм с последующей фиксацией результатов и их компьютерной обработкой с помощью программы Chromeleon 6.8.

Обращенно-фазовая высоко-эффективная жидкостная хроматография.

Хроматографию проводили на системе UltiMate 3000 фирмы Dionex, США с использованием колонки С4 с геометническими размерами 250х4,6 мм, размер частиц 5 мкм, размер пор 300 А фирмы YMC, Япония. Перед началом анализа колонку уравновешивали подвижными фазами А (0,1% трифторуксусной кислоты) и Б (0,1% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле) в соотношении 60%:40%, при скорости потока 1 мл/мин. Градиентную подачу элюентов осуществляли по следующей схеме: за первые 15 минут подача элюентов меняется линейно до соотношения 40% (подвижной фазы А): 60% (подвижной фазы Б), затем за следующие 5 минут подача подвижной фазы А линейно сводится к 0%, в таком соотношении осуществляется промывка колонки еще в течении 5 минут, после чего за 2 минуты подача элюентов возвращается к первоначальному соотношению. Температура автосамплера составляла 4±0,1 С, температура колонки 35±0,1 С. Объем вводимой пробы 25 мкл (в диапазоне концентраций 0,08 – 0,12 мг/мл). Образцы культуральной жидкости предварительно были откручены на центрифуге при скорости 10000 об/мин в течение 3 минут. Элюирующиеся с колонки вещества детектировали при длине волны 214 нм с последующей фиксацией результатов и их компьютерной обработкой с помощью программы Chromeleon 6.8.

Установление биологической активности. Установление биологической активности проводилось in vivo на линии нормоцетимических мышей породы Balb/с. В качестве калибровочного стандарта использовали Европейский стандарт рекомбинантного ЭПО – ЕРО BRP (Division of reference standards &samples (DRS), № E1515000). Мышам водилась доза активного компонента. Через 4 суток у мышей измерялось количество ретикулоцитов в крови. Подсчет количества ретикулоцитов проводился с помощью прибора ADVIA фирмы Siemens, Германия. Обсчет полученных значений выполнялся с помощью программы PLA II методом регрессионного анализа.

Резорциновый метод. Перед проведением анализа была построена калибровочная кривая по 5 точкам раствора N-ацетилнейраминовой кислоты с концентрацией 0-0,08 мг/мл. Растворы образца сравнения и субстанции дарбэпоэтина разбавляли до концентрации 0,3 мг/мл водой очищенной для дальнейшего измерения концентрации сиаловых кислот.

Смешивали 0,1 мл каждого испытуемого образца с 1 мл резорцинового реактива. Далее растворы инкубировали при температуре 150 °С в течение 50 мин. После этого все образцы были охлаждены. Затем в каждую пробирку было помещено по 2 мл смеси н-бутанол и н-бутилацетат в соотношении 12:48 частей и перемешали. Образовавшийся верхний слой синей окраски аккуратно был отобран, затем 500 мкл раствора вносили в кварцевую кювету с толщиной слоя 10 мм. После чего на спектрофотометре была измерена оптическая плотность при температуре от 15 до 25 С при длине волны 580 нм против раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют раствор для приготовления испытуемых образцов.

Содержание сиаловых кислот в растворе испытуемого образца (С) в мг/мл вычисляли по формуле: С= N*A580 ср/ k (1), где: N – коэффициент, учитывающий разведение, равный 1;

A580 – средняя оптическая плотность раствора испытуемого ср образца при длине волны 580 нм.

k- тангенс угла наклона калибровочной кривой.

Количество сиаловых кислот (моль) в испытуемом образце вычисляли по формуле:

n=(C*0.0001)/309 (2) Количество белка (моль) в испытуемом образце вычисляли по формуле:

n'=(C' *0.0001 )/31700, (3) где C'- концентрация белка в испытуемом образце (мг/мл).

Время-пролетная масспектрометрия. Образцы анализировали методом время-пролетной масс-спектрометрией с использованием матричноактивированной лазерной ионизации (MALDI) на приборе Ultraflex TOF/TOF (Bruker Daltonics, Германия). В качестве матрицы использовали стандартную для ионизации белков кислотную матрицу на основе 2,5-дигидроксибензойной кислоты (20 мг/мл 2,5-дигидроксибензойной кислоты в 50 % растворе ацетонитрила, содержащем 0,1 % тетрагидрофурана). Масс-спектрометрический анализ проводили в отражательном режиме регистрации положительно заряженных ионов.

Образцы обессоливали в микроцентрифужных концентраторах (Sartorius/ Vivaspin 500, Германия) с отсечением по молекулярной массе 10 кДа по стандартной методике.

Для этого:

200 мкл образца (0,5 мг/мл) помещали в микропробирку для концентрирования.

Цетрифугировали раствор до отметки 50 мкл 10000 об (около 12 мин).

Вносили в микропробирку 0.5 мл воды очищенной.

Центрифугировали раствор до отметки 50 мкл 10000 об (около 12 мин).

Вносили в микропробирку 0.5 мл воды очищенной.

Центрифугировали раствор до отметки 50 мкл 10000 об (около 12 мин).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Разработка методики оценки концентрации дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса производства Среди методов, позволяющих оценить уровень содержания целевого белка на фоне высоких концентраций балластных веществ, рассматривали иммуноферментный анализ (ИФА) и хроматографические методы.

ИФА является одним из самых распространенных методов количественного определения целевых белков на фоне многокомпонентных неспецифических смесей веществ. Так, для определения ЭПО как в плазме крови, так и в культуральной жидкости существуют сертифицированные коммерческие системы ИФА, отличающиеся высокой специфичностью и чувствительностью [85, 86]. В то же время для дарбэпоэтина не существует доступных и сертифицированных ИФА систем. Различная антигенная специфичность дарбэпоэтина и ЭПО не позволили нам использовать одну из самых распространенных ИФА систем Эритропоэтин-ИФА-БЕСТ (Вектор-Бест, Россия) для количественного определения дарбэпоэтина в культуральной жидкости в связи с низкой чувствительностью и узким диапазоном линейности метода при оценке концентрации дарбэпоэтина.

В связи с этим перед нами была поставлена задача по разработке хроматографической методики оценки количества дарбэпоэтина в различных смесях.

В качестве базового метода для разработки использовали метод аффинной хроматографии.

Метод аффинной хроматографии основан на специфичном взаимодействии молекул целевого белка дарбэпоэтина с лигандами, связанными с инертным носителем. В качестве лигандов были использованы моноклональные антитела к ЭПО, полученные в лаборатории иммунологии ФГУП ГосНИИгенетика, специфичность которых в отношении дарбэпоэтина была установлена при сопоставлении эффективности выделения ЭПО и дарбэпоэтина из культуральных жидкостей.

Выделение рекомбинантных белков из культуральной жидкости проводили на иммуноаффинном сорбенте, объемом 100 мл. Культуральную жидкость объемом около 1 л, содержащую ЭПО или дарбэпоэтин в концентрации от 50 до 100 мкг/мл, нанесли на сорбент. Элюцию целевого белка проводили глициновым буфером с рН 2,0 после стадии удаления неспецифических примесей.

Концентрацию каждого из белков в элюате устанавливали методом УФспектрометрии. Полученные в ходе хроматографирования культуральной жидкости, содержащей дарбэпоэтин, фракции были проанализированы в белковом электрофорезе (Рисунок 6).

Результаты, представленные на рисунке 6, показывают наличие целевого белка в элюате и незначительное количество в буферном растворе после элюции дарбэпоэтина с колонки. Полученные данные свидетельствуют о специфичности иммуноаффинного сорбента к дарбэпоэтину.

Рисунок 6. Электрофореграмма фракций, полученных в ходе препаративной аффинной хроматографии Анализ элюата с аффинного сорбента методом изоэлектрофокусирования показал наличие полного спектра изоформ дарбэпоэтина, соответствующего профилю гликозирования белка в культуральной жидкости, и наличие высоко сиалированных изоформ, соответствующих коммерческому препарату Аранесп (Рисунок 7А).

Сопоставление спектра изоформ в аффинном элюате и Аранеспе проведено также методом КЗЭ (Рисунок 7Б), который также подтвердил наличие целевых форм белка в аффинном элюате дарбэпоэтина.

Рисунок 7. Электрофореграммы образца аффинного элюата дарбэпоэтина, полученные с помощью изоэлектрического фокусирования (А) и КЗЭ (Б) В дальнейшем была предпринята попытка оптимизации данной метода для его рутинного применения в качестве аналитической методики для установления количественного содержания дарбэпоэтина в образцах культуральной жидкости.

Для этого аналитическая колонка Tricorn 5/20 была заполнена аффинным сорбентом, использующемся при препаративном выделении белка, объемом не более 300 мкл.

Использующиеся буферные растворы имели следующий состав:

буферный раствор для нанесения белка на колонку - 150 мМ NaCl, 20 мМ Na3PO4, 0,05% Tween-20, рН 7,4; элюирующий буферный раствор - 150 мМ NaCl, 20 мМ Na3PO4, 0,05% Tween-20, рН 2,0. При этом подача элюентов осуществлялась ступенчато по схеме: первые четыре минуты буферный раствор для нанесения белка, затем элюирующий буферный раствор (100% за 1 с), на 15 минуте - буфер для нанесения белка (100% за 1 с). Скорость потока составляла 0,2 мл/мин.

Использование двойного ступенчатого градиента позволяет предотвратить размытие целевого пика на хроматограмме, а также сохранить аффинный сорбент от воздействия низкого рН элюирующего буфера.

В ходе хроматографирования была попытка идентифицировать целевой пик при анализе препарата сравнения Аранесп. Попытка детекции дарбэпоэтина в стандартных условиях (то есть в УФ-спектре при длине волны 214 нм) была неудачной, поскольку идентифицировать пик при резком изменении базовой линии и при малом количестве самого белка было невозможно (Рисунок 8).

–  –  –

Рисунок 8. Хроматограмма образца сравнения Аранесп с концентрацией дарбэпоэтина 10 мкг/мл, полученная в ходе разработки методики аффинной хроматографии.

Детекция при длине волны 214 нм

–  –  –

-5,000,000

-10,000,000

-15,000,000

-20,000,000

-25,000,000

–  –  –

Рисунок 9. Хроматограмма образца сравнения Аранесп с концентрацией 10 мкг/мл, полученная при разработке аффинной методики.

Детекция белка проводилась с помощью флюорометрического детектора

–  –  –

Рисунок 10. Сравнение хроматографических профилей бланка и образца сравнения, полученных при проведении аффинной хроматографии Данное обстоятельство потребовало дополнительных разработок проведения анализа для минимизации эффекта раздвоения пика, а именно смены имеющихся буферных растворов.

Эксперименты по подбору таких условий привели к выбору системы элюентов следующего состава:

подвижная фаза А– 150 мМ NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 7.4, подвижная фаза B – 1М NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 2.0.

Ступенчатую подачу элюентов А и В осуществляли последовательно по следующей схеме: 0-7 мин элюент А (150 мМ NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 7.4), 7-12 мин элюент B (1М NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 2.0), затем шло уравновешивание колонки подвижной фазой А. Данные условия позволили минимизировать перепад в базовой линии и влияние такого перепада на внешний вид пика соответствующего целевому белку (Рисунок 11).

2012_01_30 #12 EPO_10 mg_l Emission_1 5,000,000 counts 4,000,000

–  –  –

Рисунок 11. Хроматограмма образца сравнения Аранесп с концентрацией дарбэпоэтина 10 мкг/мл, полученная в ходе разработки методики аффинной хроматографии Позже при проведении предвалидационных исследований было обнаружено, что результаты, полученные для ряда образцов, не воспроизводятся.

Проведенные эксперименты по поиску причины невоспроизведения результатов позволили установить, что при данных условиях не происходит полной элюции белка с аффинного сорбента, что приводит к его постепенному накоплению на сорбенте. Данная проблема потребовала еще раз провести подбор более подходящих условий.

В итоге были выбрана следующая система буферных растворов:

подвижная фаза А– 150 мМ NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 7.4, подвижная фаза В – 3М NaCl, 10 мМ Na3PO4, рН 2.0, подвижная фаза С – 2М глицин, рН 2.0.

При скорости потока 0,2 мл/мин ступенчатую подачу элюентов осуществляли по следующей схеме: с 0 по 7 минут - элюент А, с 7 по 12 минуту происходила подача элюента B, с 12 по 17 минуту - элюент С. Подобранные условия продемонстрировали приемлемость разработанной методики для ее дальнейшего применения.

В связи с этим была проведена полная валидация методики по критическим параметрам.

Помимо аффинной хроматографии в качестве альтернативной методики количественного определения дарбэпоэтина нами была осуществлена попытка разработки методики ОФ ВЭЖХ, которая традиционно используется для количественных определений широкого спектра белков и органических соединений, и основанная на разделении белковых и органических веществ по степени их полярности. В современной науке ОФ ВЭЖХ является одним из самых распространенных методов оценки, как качества, так и количества активного компонента. В связи с этим нами и был выбран этот метод для применения его к дарбэпоэтину.

Так как в литературе нет описанной методики количественного определения дарбэпоэтина в культуральной жидкости с помощью ОФ ВЭЖХ, то нами была проделана работа по подбору условий проведения анализа. Первоначально нами была выбрана обращено-фазовая колонка С18 как наиболее популярная для разделения различных смесей. В качестве буферных растворов использовались элюент А –0,1% трифторуксусная кислота (ТФУ); элюент Б –0,1 % ТФУ в ацетонитриле. Детекция осуществлялась в УФ-области при длине волны 214 нм.

Скорость потока 1 мл/мин. В качестве анализируемого материала использовали Аранесп с концентрацией дарбэпоэтина 0,1 мг/мл, вкол составлял 25 мкл.

Температура колонки составляла 35 °С. Градиент подачи элюентов изначально был выбран следующий: начало анализа происходит при стартовом соотношении буфера А 70% и буфера Б 30%, далее за первые 25 минут происходит изменение соотношения буфера А до 0% и буфера Б до 100%, при таком соотношении проходила промывка колонки в течении 5 минут, после чего за 1 минуту происходит возвращение к стартовым условиям. Полученная в описанных условиях хроматограмма не показала никакой информативности (Рисунок 12), данное обстоятельство требовало дальнейшей разработки методики.

2012_10_22 #3 [modified by dionexdep1] aff el UV_VIS_1 mAU WVL:210 nm

-100

–  –  –

Рисунок 13. Хроматограмма образца сравнения Аранесп с концентрацией дарбэпоэтина 0,1 мг/мл, полученная в ходе разработки ОФ ВЭЖХ при смене схемы подачи элюентов Для более точной идентификации был также сделан вкол матрикса образца сравнения Аранесп (Рисунок 14).

–  –  –

Рисунок 14. Хроматограмма матрикса образца сравнения Аранесп, полученная в ходе разработки методики ОФ ВЭЖХ Как видно из приведенных хроматограмм, сделать четкого вывода по возможности идентифицировать пик дарбэпоэтина в этих условиях также не представлялось возможным, так как в матриксе идентифицируется такой же пик.

В ходе дальнейшей работы был подобран оптимальный градиент элюции:

35% элюента А и 65 % элюента Б – стартовое соотношение, за 5 минут достигается соотношение 15% элюента А и 85% элюента Б, за следующие 5 минут количество элюента Б повышается на 10% и еще за 5 минут достикает 100%. В таком соотношении колонка находится в течении 5 минут, после чего за 1 минуту возвращается к стартовым условиям (Рисунок 15).

–  –  –

Однако при дальнейших экспериментах методика не продемонстрировала воспроизводимости.

В дальнейшей работе было использовано еще несколько различных схем градиентной подачи элюентов. Однако полученные результаты продемонстировали невозможность получения приемлемого аналитического разделения образцов, содержащих дарбэпоэтин, на сорбенте С18. В результате было принято решения смены сорбента на С4, характеризующегося более слабой гидрофобностью в сравнении с С18. Все остальные условия проведения анализа были оставлены без изменения. Градиентная подача элюентов осуществлялась по схеме, описанной выше со стартого соотношения буферов 90% (элюент А) и 10% элюент Б. Полученная хроматограмма приведена на рисунке 16.

–  –  –

Рисунок 16. Хроматограмма образца сравнения Аранесп, полученная в ходе разработки методики ОФ ВЭЖХ при смене сорбента на С4 Идентифицированный пик полностью удовлетворял всем необходимым хроматографическим показателям качества – ассиметрия пика составляла 1,05, число теоретических тарелок около 1500, что является абсолютно приемлимым для данного вида хроматографии. Однако нами была изменена схема подачи элюентов для достижения более раннего выхода пика, соответствующего дарбэпоэтину. В результате нами была выбрана следующая схема градиента элюентов: стартовое соотношение элюентов - 60 % элюента А и 40% элюента Б, в течение 15 минут происходит линейное изменение соотношения элюентов до 40% элюента А и 60% элюента Б, после чего еще в течении 5 минут увеличивается количество элюента Б до 100%, здесь проходит промывка колонки на протяжении 5 минут, после чего за 2 минуты соотношение возвращается до стартовых условий и происходит уравновешивание колонки. Режим хроматографирования был выбран по следующим параметрам: время удерживания дарбэпоэтина не более трех объемов колонки (не более 14 мин), фактор асимметрии пика 0,8 – 1,4, эффективность разделения не менее 600 теоретических тарелок. В результате была получена хроматограмма приведенная на рисунке 17.

–  –  –

После разработки методики следующей задачей была его валидация.

Валидацию проводили по основным параметрам присущим аналитической методике количественного определения.

Полученные данные и параметры аналитического метода ОФ ВЭЖХ были использованы в экспериментах по идентификации целевого белка – дарбэпоэтина в культуральной жидкости. С этой целью разработанным методом анализировали образцы культуральной жидкости и образцы, содержащие коммерческий дарбэпоэтин. В качестве отрицательного контроля использовали образцы, несодержащие целевой белок – культуральная среда до засева клеток и культуральная жидкость, освобожденная от дарбэпоэтина в ходе иммуноаффинной хроматографии. Для исключения неспецифических сигналов в области поглощения целевого белка также проводили разделение образца фосфатного буфера, содержащего вспомогательные вещества готовой лекарственной формы дарбэпоэтина.

Полученные результаты представлены на рисунке 18 и в таблице 3.

Рисунок 18. Хроматограммы, полученные для оригинального препарата Аранесп с нагрузкой на колонку по дарбэпоэтину 0,5 мкг (А), образца культуральной жидкости дарбэпоэтина (Б), смешанного образца культуральной жидкости и оригинального препарата (В), а также для буферного раствора ГЛФ (Г), культуральной среды (Д) и культуральной жидкости, освобожденной от дарбэпоэтина (Е) Время удерживания основного пика на хроматограммах образцов культуральной жидкости, содержащих дарбэпоэтин (Рисунок 18Б и 18В), отличается от времени удерживания балластных веществ культуральной среды и соответствует времени удерживания основного пика в образце, содержащем коммерческий дарбэпоэтин (Рисунок 18А).

Введение в образец культуральной жидкости коммерческого дарбэпоэтина с известной концентрацией позволило установить пропорциональную зависимость между концентрацией дарбэпоэтина в образце и площадью основного пика.

Степень извлечения в данном случае составляла 101%.

–  –  –

На хроматограммах образцов буфера ГЛФ, культуральной среды до засева клеток и культуральной жидкости, освобожденной от дарбэпоэтина, пиков не зафиксировано.

При этом было показано, что содержание целевого белка в основном пике культуральной жидкости при электрофоретическом разделении составляет не менее 98%, а дополнительные примесные пики (в левом и правом плечах основного пика) не содержат дарбэпоэтина (Рисунок 19).

Рисунок 19.

Электрофореграмма образца культуральной жидкости дарбэпоэтина, фракционированного методом ОФ ВЭЖХ на сорбенте С4:

1– стандарт молекулярных масс; 2– образец культуральной жидкости; 3– фракция, собранная из левого плеча основного пика; 4– основной пик в культуральной жидкости; 5– фракция, собранная из правого плеча основного пика; 6– образец сравнения Аранесп.

Специфичность дарбэпоэтина в основном пике и в образце культуральной жидкости были подтверждены с помощью иммуноблоттинга с применением специфических антител к ЭПО (Рисунок 20).

Рисунок 20. Электрофореграмма хроматографических фракций дарбэпоэтина: 1 – стандарт молекулярных масс; 2– основной пик при хроматографировании препарата Аранесп; 3– левое плечо основного пика при хроматографировании культуральной жидкости дарбэпоэтина; 4 – основной пик на хроматограмме культуральной жидкости дарбэпоэтина; 5 – правое плечо основного пика при хроматографировании культуральной жидкости дарбэпоэтина; 6 – исходная культуральная жидкость дарбэпоэтина.

Из результатов иммунопроявления следует, что во фракции основного пика детектируется дарбэпоэтин, в то время как в левом и правом плече не детектируется полос, что свидетельствует об отсутствии в этих фракциях целевого белка. Таким образом, в основном пике при хроматографировании образцов культуральной жидкости идентифицируется целевой белок, экспрессируемый клоном-продуцентом и ОФ ВЭЖХ может быть использован для оценки уровня экспрессии белка в процессе культивирования после валидации параметров методики количественного определения.

Таким образом, метод ОФ ВЭЖХ позволяет проводить идентификацию (по времени выхода) и количественное определение дарбэпоэтина (по площади пика) в образцах культуральной жидкости.

2.2.2. Валидация разработанных хроматографических методик количественного определения дарбэпоэтина Поскольку обе методики относится к методикам установления количественного содержания активного компонента, то они были валидирована по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность, повторяемость, промежуточная прецизионность, ПКО, диапазон применения и робастность [78, 80].

Валидация методики количественного определения дарбэпоэтина с Определение специфичности. Для помощью аффинной хроматографии.

подтверждения специфичности сравнивали результаты анализа проб культуральной жидкости, освобожденной от дарбэпоэтина, культуральной жидкости дарбэпоэтина и в качестве стандарта образец сравнения Аранесп.

Анализ профилей полученных хроматограмм показал, что пик дарбэпоэтина достоверно определяются на фоне компонентов стандартно присутствующих в образцах культуральной жидкости. Разница во времени удерживания пика аналита на хроматограммах испытуемого образца культуральной жидкости и образца сравнения Аранесп составляет менее 0,2 минут. Типичные хроматограммы культуральной среды, образца сравнения и образца культуральной жидкости дарбэпоэтина представлены на рисунке 21.

Рисунок 21. Хроматограммы образца сравнения Аранесп с концентрацией дарбэпоэтина 10 мг/л (А), культуральной жидкости, освобожденной от дарбэпоэтина с помощью аффинной хроматографии (Б), образец культуральной жидкости дарбэпоэтина (В). Время выхода пика дарбэпоэтина лежит в диапазоне от 9,7 до 10,3 минут.

Результаты, полученные в ходе установления рассматриваемого параметра, позволили сделать вывод о специфичности методики.

Определение линейности. Для оценки линейности проводили анализ серии из 7 растворов образца сравнения Аранесп с концентрациями в диапазоне от 5 до 20 мг/л. Растворы готовили путем разведения исходного раствора образца сравнения с помощью подвижной фазы А. Каждый образец анализировался в трех повторностях. На основании полученных данных, представленных в таблице 4, были рассчитаны коэффициенты регрессионной прямой вида y=b*x+a методом наименьших квадратов, где у – значение измеренной площади пика дарбэпоэтина (Counts/1000000), рассчитанное по трем хроматограммам, х – внесенное количество дарбэпоэтина (мг/л).

–  –  –

Уравнение и график регрессионной прямой для дарбэпоэтина приведены на рисунке 22.

Рисунок 22. Калибровочный график зависимости площади пика дарбэпоэтина от его концентрации в образце Квадрат линейного коэффициента корреляции (r2) характеризует степень соответствия между регрессионной моделью и исходными данными. В данном случае 99,84% изменений зависимой переменной описывается регрессионным уравнением. Коэффициент корреляции (r) для дарбэпоэтина равен 0,9992.

Поскольку коэффициенты корреляции положительные и превышают 0,9900, между измеренной площадью пика и концентрацией аналита в образце существует прямая линейная зависимость.

Были рассчитаны регрессионные остатки и построены графики зависимости остатка от концентрации аналита (Рисунок 23). Остатки рассчитывали как разницу между измеренным значением площади пика и значением, рассчитанным по уравнению регрессионной прямой. Значения остатков приведены в таблице 4.

Рисунок 23. График зависимости величины остатка от концентрации дарбэпоэтина Как видно на рисунке 23, не наблюдается зависимость величины остатков от значения концентрации аналита, то есть рассеяние данных возле линии регрессии одинаково при всех значениях переменной х.

Определение правильности.

Для оценки правильности для всех растворов, проанализированных в ходе установления линейности, рассчитывали величины степени извлечения (Recovery, %) по формуле:

Recovery = 100*Cизм/Стеор, (4) где Сизм – среднее значение измеренного количества аналита, рассчитанное по трем повторностям, мг/л, Стеор – внесенное количество аналита, мг/л.

Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных по уравнению линейной зависимости, от фактических значений приведены в таблице 5.

–  –  –

Полученные значения степени извлечения для каждого аналита лежат в диапазоне от 95 до 105 %, что свидетельствует о высокой степени соответствия между истинным значением аналита и его значением, полученным по данной методике.

Определение прецизионности. Для характеризации прецизионности методики при ее выполнении в одних и тех же условиях в течение небольшого промежутка времени для всех растворов, проанализированных в ходе установления линейности в трех повторностях, рассчитывали величину

–  –  –

Рассчитанная величина относительного стандартного отклонения не превышает 3 %, что является хорошим показателем внутрилабораторной прецизионности результатов.

Определение предела количественного определения (ПКО). Ввиду низких номинальных значений аналита в образце, было определено минимальное количество аналита, которое может быть количественно определено с помощью данной методики.

Для расчета ПКО использовали формулу:

ПКО=10* SD/b, (7) где SD – стандартное отклонение аналитического сигнала в диапазоне времени выхода аналита для матричного раствора, рассчитанное по трем хроматограммам, b – тангенс угла наклона регрессионной прямой.

ПКО методики для дарбэпоэтина составил 0,39 мг/л (таблица 7).

–  –  –

Определение аналитического диапазона методики. Аналитический диапазон методики на основании результатов оценки линейности и точности методики составил 5-20 мг/л.

Проверка пригодности системы. Из полученной в ходе валидации информации для подтверждения правильной работы системы были разработаны критерии пригодности методики, которые должны соблюдаться при каждом анализе (Таблица 8).

Таблица 8. Критерии пригодности системы для аффинной хроматографии Параметр Спецификация Время выхода пика дарбэпоэтина 9,5 – 10,5 минут Относительное стандартное 1% отклонение по времени выхода пика дарбэпоэтина, рассчитанное по трем вколам Относительное стандартное 3% отклонение по площади основного пика, рассчитанное по трем вколам Среднее значение ассиметрии пика, 0,8 -1,5 рассчитанное по трем хроматограммам Робастность.

Так как методика была разработана впервые, то по всем международным правилам, также ее необходимо проверить на устойчивость к незначительным внешним изменениям. Наиболее важным параметром, который может встретиться при дальнейшей работе с данной методикой является серия рабочего сорбента. Для проверки робастности, нами была протестирована другая серия сорбента. Полученные результаты приведены в таблице 9.

–  –  –

Полученные данные свидетельствуют о том, что методика стабильно работает при смене сорбента, что говорит о надежности разработанной методики.

Таким образом, разработанная методика количественного определения дарбэпоэтина в культуральной жидкости методом аффинной хроматографии была валидирована по основным валидационным параметрам, что доказывает ее возможное применение для количественной оценки содержания дарбэпоэтина в культуральной жидкости.

Валидация методики количественного определения дарбэпоэтина с помощью ОФ ВЭЖХ. Определение специфичности. В первую очередь для данной методики была установлена селективность относительно двух близкородственных соединений - ЭПО и дарбэпоэтина (Рисунок 24).

Рисунок 24. Хроматограммы стандартного образца эритропоэтина BRP 0,2 мг/мл и образца сравнения дарбэпоэтина Аранесп 0,1 мг/мл, полученные в ходе установления селективности методики ОФ ВЭЖХ Представленные на рисунке 24 данные демонстрируют различия между ЭПО и дарбэпоэтином по времени удерживания и степени поглощения при длине волны 214 нм, что свидетельствует о возможности идентификации каждого из этих белков данным методом. Полученный результат был подтвержден при анализе образца, содержащего эквивалентные количества ЭПО и дарбэпоэтина (0,1 мг/мл) (Рисунок 25).

Рисунок 25. Хроматограмма, полученная для образца, содержащего эквивалентные количества ЭПО и дарбэпоэтина Для оценки специфичности методики были проанализированы следующие образцы: образец сравнения Аранесп, образец культуральной жидкости дарбэпоэтина, образец элюата, матрикс, элюент, использующийся в препаративной хроматографии и культуральная жидкость, освобожденная от дарбэпоэтина. Полученные хроматограммы приведены на рисунке 26.

Рисунок 26. Хроматограммы A) образца сравнения Аранеспа с концентрацией 0,1 мг/л, Б) элюата дарбэпоэтина, полученного при ионообменной хроматографии, В) образца культуральной жидкости, Г) матрикса, Д) элюента, использующегося при выделении дарбэпоэтина и Е) культуральной жидкости, освобожденной от дарбэпоэтина. Время выхода пика дарбэпоэтина от 8,5 до 10,5 минут Полученные данные демонстрируют возможность разработанной методики проводить идентификацию дарбэпоэтина, поскольку в образцах отрицательного контроля не идентифицируется пиков с временем удерживания, соответствующим времени удерживанию пика дарбэпоэтина, тогда как в образцах ГЛФ, элюата дарбэпоэтина и культуральной жидкости дарбэпоэтина детектируется целевой белок. Результаты позволяют считать методику специфичной.

Определение линейности. Для оценки линейности проводили анализ серии из 5 растворов образца сравнения Аранесп с концентрациями в диапазоне от 0,80 до 0,12 мг/мл. Каждый образец анализировали в трех повторностях. На основании полученных данных, представленных в таблице 10, методом наименьших квадратов были рассчитаны коэффициенты регрессионной прямой вида y=b*x+a, где у – значение измеренной площади пика дарбэпоэтина (mAU*min), рассчитанное по трем хроматограммам, х –количество анализируемого белка в образце (мг/мл).

Таблица 10. Оценка линейности методики количественного определения дарбэпоэтина с помощью ОФ ВЭЖХ

–  –  –

Уравнение и график регрессионной прямой для дарбэпоэтина приведены на рисунке 27.

Рисунок 27. Калибровочный график зависимости площади пика дарбэпоэтина от его концентрации в образце Квадрат линейного коэффициента корреляции (r2) характеризует степень соответствия между регрессионной моделью и исходными данными. В данном случае 99,59% изменений зависимой переменной описывается регрессионным уравнением. Коэффициент корреляции (r) для дарбэпоэтина равен 0,997.

Поскольку коэффициент корреляции положительный и превышает 0,990, между измеренной площадью пика и концентрацией аналита в образце существует прямая линейная зависимость.

Были рассчитаны регрессионные остатки и построен график зависимости остатка от концентрации аналита (рисунок 28). Остатки рассчитывали как разницу между измеренным значением площади пика и значением, рассчитанным по уравнению регрессионной прямой. Значения остатков приведены в таблице 10.

Рисунок 28. График зависимости величины остатка от концентрации дарбэпоэтина Как видно на рисунке 28, рассеяние данных возле линии регрессии одинаково при всех значениях переменной х, то есть зависимости величины остатков от значения концентрации аналита не наблюдается.

Определение правильности. Для оценки правильности для всех концентраций образцов дарбэпоэтина, проанализированных в ходе установления линейности, рассчитывали величины степени извлечения (Recovery, %) по формуле 4.

Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных по уравнению линейной зависимости, от фактических значений приведены в таблице 11.

–  –  –

Полученные значения степени извлечения для рекомбинантного белка лежат в диапазоне от 95 до 105 %, что свидетельствует о высокой степени соответствия между истинным значением аналита и его значением, полученным по данной методике.

Определение прецизионности. Для характеризации прецизионности методики при ее выполнении в одних и тех же условиях в течение небольшого промежутка времени для всех растворов, проанализированных в ходе установления линейности в трех повторностях, рассчитывали величину относительного стандартного отклонения значений измеренной концентрации аналита (RSD, %) по формуле 5. Полученные величины относительного стандартного отклонения не превышают 2 % (таблица 11), что является хорошим показателем сходимости результатов для серии измерений.

Для оценки влияния внутрилабораторных вариаций анализировали в трех повторностях в различные дни растворы с концентрацией 0,1 мг/мл дарбэпоэтина и рассчитывали величину относительного стандартного отклонения площади пика аналита (RSD, %) по формуле 6. Результаты приведены в таблице 12.

–  –  –

Рассчитанная величина относительного стандартного отклонения не превышает 2 % (таблица 12), что является хорошим показателем внутрилабораторной прецизионности результатов.

Определение ПКО. Ввиду низких номинальных значений аналита в образце, было определено минимальное количество дарбэпоэтина, которое может быть количественно определено с помощью данной методики.

Для установления параметра были приготовлены образцы коммерческого препарата Аранесп с концентрацией белка 0,01 мг/мл, после чего образец был нанесен на колонку в разном объеме – 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 мкл. ПКО устанавливался при идентификации пика белка с высотой пика превышающей шум в 10 раз. В ходе проведенного эксперимента установлено, что для дарбэпоэтина ПКО составляет 0,25 мкг.

Определение аналитического диапазона методики ОФ ВЭЖХ.

Аналитический диапазон методики на основании результатов оценки линейности и точности методики составил 0,8 – 1,2 мг/мл для каждого аналита.

Проверка пригодности системы ОФ ВЭЖХ. Из полученной в ходе валидации информации для подтверждения правильной работы системы были разработаны критерии пригодности методики, которые должны соблюдаться при каждом анализе (Таблица 13).

Таблица 13. Критерии пригодности системы ОФ ВЭЖХ Параметр Спецификация Время выхода пика дарбэпоэтина 8,5 – 10,5 минут Относительное стандартное 1% отклонение по времени выхода пика дарбэпоэтина, рассчитанное по трем вколам Относительное стандартное 2% отклонение по площади основного пика, рассчитанное по трем вколам Среднее значение ассиметрии пика, 0,8 -1,2 рассчитанное по трем хроматограммам Среднее значение теоритических 1500 тарелок, рассчитанное по трем хроматограммам Робастность. Так как методика была разработана впервые, то для дальнейшей уверенности в ее надежности необходимо установить ее стабильность при работе при небольшой смене внешних условий. Данная методика была протестирована при изменении температуры колонки в диапазоне ±2 °С и при смене серии колонки. В таблице 14 приведены результаты проведенного эксперимента.

–  –  –

Полученные данные свидетельствуют о том, что методика достаточно стабильно работает при вариациях температуры колонки и смене серии колонки, что говорит о надежности разработанной методики.

Оценка основных аналитических параметров хроматографической методики количественного определения содержания дарбэпоэтина показала, что методика на основе ОФ ВЭЖХ является специфичной для дарбэпоэтина и позволяет получать достоверные данные о содержании данного рекомбинантного белка в культуральной жидкости, элюате и субстанции.

Проведенная работа показала, что по основным параметрам аналитических методик методика количественного определения дарбэпоэтина с помощью ОФ ВЭЖХ превосходит методику аффинной хроматографии, поскольку сходимость и внутрилабораторная прецизионность имеют меньшее RSD. Кроме того, проведенная валидация показала низкую экономическую эффективность аффинной хроматографии, связанную с большой стоимостью моноклональных антител и малым количеством рабочих циклов сорбента. Таким образом, при дальнейшей работе было решено использовать методику ОФ ВЭЖХ для количественного определения дарбэпоэтина в продуктах, полупродуктах и культуральной жидкости.

–  –  –

На всех технологических этапах необходимо было также проводить исследование уровня гликозилирования целевого белка. Для этого использовали два метода: капиллярный зональный электрофорез и изоэлектрическое фокусирование.

Трудности использования капиллярного электрофореза для анализа образцов культуральной жидкости, содержащих дарбэпоэтин, связаны с низкой концентрацией целевого белка в культуральной среде и с невозможностью идентификации пиков изоформ дарбэпоэтина на фоне пиков неспецифических примесей с аналогичной подвижностью.

Поэтому для таких образцов требовалось использование другого метода, обладающего достаточной чувствительностью и способного специфично выявлять изоформы дарбэпоэтина. В качестве такого метода нами был рассмотрен метод изоэлектрического фокусирования в геле с последующей окраской раствором Кумасси.

В ходе решения поставленной задачи была проведена оптимизация методики изоэлектрического фокусирования для определения изоформенного состава дарбэпоэтина. На Рисунке 29 приведена электрофореграмма с раститровкой образца сравнения дарбэпоэтина при установлении предела обнаружения. Из данных электрофореграммы видно, что оптимизированный метод подходит для разделения изоформ дарбэпоэтина, причем само разделение изоформ гликазилированного белка происходит именно в области низкого градиента рН - около 2.

Рисунок 29. Электрофореграмма, полученная с помощью проведения изоэлектрического фокусирования с последующей окраской раствором Кумасси Проведенный эксперимент позволил установить предел обнаружения оптимизированного метода для дарбэпоэтина, которым являлась нагрузка 5 мкг, что не совсем удовлетворяет нашим требованиям, так как культуральная жидкость содержит помимо целевых изоформ еще большое количество более щелочных форм белка, что требует большей нагрузки на дорожку. В связи с этим для образцов, содержащих малое количество целевых форм дарбэпоэтина, было целесообразно разработать процедуру иммуноблоттинга после изоэлектрического фокусирования с окраской специфическими антителами к ЭПО. Данная модификация позволила повысить чувствительность методики и идентифицировать целевые изоформы в образцах культуральной жидкости (Рисунок 30).

Данный метод позволяет определять качественный состав изоформ дарбэпоэтина и идентифицировать целевые формы белка с различной степенью гликозилирования в диапазонах pI от 2,0 до 10 (Рисунок 30). Чувствительность метода составляет 0,20 мкг.

Рисунок 30. Электрофореграмма, полученная после проведения изоэлектрического фокусирования и иммуноблоттинга образцов культуральной жидкости дарбэпоэтина и оригинального препарата Аранесп Метод изоэлектрического фокусирования был использован для характеристики клонов с высокой продуктивностью целевого белка, а также для контроля качества гликозилирования на всех этапах культивирования. Для подтверждения корректности получаемых результатов была проведена валидация рассматриваемой методики.

Таким образом, на этапе получения штамма клона продуцента дарбэпоэтина и его культивировании нами были выбраны два основных параметра - это концентрация дарбэпоэтина и его качественный состав в культуральной жидкости. Для этого были подобраны, разработаны и оптимизированы такие методы, как ОФ ВЭЖХ и изоэлектрическое фокусирование с последующим иммуноблоттингом. Для гарантии получения надежных результатов нами была проведена полная валидация обеих методик.

2.2.4. Валидация методики установления подлинности дарбэпоэтина с помощью изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом Валидация методики установления подлинности дарбэпоэтина проведена по параметрам специфичность и предел обнаружения.

Специфичность устанавливалась для образцов культуральной жидкости, элюата и субстанции. Для этого были проанализированы образцы культуральной жидкости дарбэпоэтина, элюата дарбэпоэтина, Аранеспа, культуральной среды, освобожденной от целевого белка (с помощью аффинной хроматографии), элюирующего буфера и матрикса (Рисунок 31).

Рисунок 31. Электрофореграммы, полученные в ходе валидации для образцов А) культуральной жидкости дарбэпоэтина и культуральной среды, освобожденной от дарбэпоэтина; Б) элюата дарбэпоэтина и элюирующего буфера;

В) оригинального препарата и матрикса Полученные электрофореграммы свидетельствуют о возможности идентифицировать наличие целевых изоформ дарбэпоэтина в продуктах и полупродуктах (даже таких сложных как культуральная жидкость) с помощью изоэлектрического фокусирования с дальнейшим применением иммуноблоттинга.

Для установления предела обнаружения на гель наносили оригинальный препарат Аранесп с разной нагрузкой (400 нг, 200 нг, 100 нг).

Рисунок 32. Установление предела обнаружения методики изоэлектрического фокусирование с дальнейшим применением иммуноблоттинга Предел обнаружения устанавливался с помощью программного обеспечения GenTools, позволяющего проводить обработку гелей и мембран.

Пределом обнаружения считается такое количество белка, которое позволяет детектировать полосы с интенсивностью окрашивания, превышаюшей интенсивность фона более чем в три раза. Из полученных данных удалось установить, что такому требованию соответствует нагрузка в 200 нг.

Таким образом, поставленные эксперименты позволили считать методику специфичной, а предел обнаружения был установлен на уровне 200 нг.

2.2.5. Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса Из первичного пула трансфецированных клеток было получено около 50 стабильных клонов продуцента дарбэпоэтина. Все клоны культивировали в одинаковых условиях в химически определенной, бессывороточной среде производства Lonza, Швейцария.

Разработанный метод ОФ ВЭЖХ позволил провести мониторинг клонов продуцента дарбэпоэтина на ранних этапах культивирования и идентифицировать клоны с максимальной продуктивностью по целевому белку (таблица 15).

Аналитический метод ОФ ВЭЖХ был использован для оценки содержания целевого белка в культуральной жидкости на разных этапах культивирования и во фракциях при поэтапном выделении дарбэпоэтина.

Культивирование линии продуцента проводили в колбах, а затем в волновом биореакторе с объемом 5 л, с использованием коммерческих питательных сред.

В ходе культивирования осуществляли контроль накопления дарбэпоэтина в культуральной среде и степень его гликозилирования. Данные параметры служили основанием для выбора оптимальных условий культивирования линии клеток - продуцента.

Содержание дарбэпоэтина в культуральной жидкости оценивали разработанным методом ОФ ВЭЖХ. Степень гликозилирования дарбэпоэтина на всех этапах культивирования оценивали методом изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом.

В таблице 15 представлены результаты мониторинга уровня накопления дарбэпоэтина в нескольких процессах культивирования на средах разного состава (№1 – 10). Культивирование проводили в колбах с объемом питательной среды 200 мл.

Как видно из представленных в таблице 15 данных, время выхода основного пика в образцах культуральной жидкости разных серий составляет от 9,44 до 9,59 минут. Данный параметр указывает на хорошую стабильность методики. В свою очередь, концентрация дарбэпоэтина, оцененная методом ОФ ВЭЖХ, увеличивается пропорционально времени культивирования, что говорит о том, что с течением времени культивирования происходит накопление целевого белка в культуральной среде.

–  –  –

Помимо контроля накопления дарбэпоэтина в культуральной жидкости проводили мониторинг качественного состава дарбэпоэтина в тех же образцах культуральной жидкости на самые поздние сутки с помощью изоэлектрического фокусирования (Рисунок 33).

Рисунок 33. Электрофореграмма образцов культуральной жидкости дарбэпоэтина, полученная в ходе мониторинга качественного состава целевого белка при культивировании линии клона продуцента дарбэпоэтина Приведенная электрофореграмма демонстрирует разницу качественного состава изоформ дарбэпоэтина в образцах культуральной жидкости. Так, например, видно, что образцы культуральной жидкости серии 151113 колбы 1 и колбы 2, а также серии 081113 колбы 10 не содержат самой сиалированной изоформы дарбэпоэтина, хотя по результатам ОФ ВЭЖХ имеют одни из самых высоких концентраций белка, в свою очередь образец серии 081113 колбы 6 имеет высоко сиалированную форму дарбэпоэтина, но ее концентрация по интенсивности окрашивания ниже, чем в остальных образцах культуральной жидкости.

Таким образом, методика изоэлектрофокусирования образцов культуральной жидкости может быть использована для оценки степени гликозилирования дарбэпоэтина в ходе процесса культивирования. Результаты определения профиля гликозилирования разработанным методом были использованы для корректировки условий культивирования штамма-продуцента путем внесения дополнительных питательных веществ в ходе реакторного глубинного процесса культивирования. В результате проведения трех различных процессов реакторного культивирования были получены серии культуральной жидкости 340314, 350314 и 360314. После культивирования следующим технологическим этапом производства субстанции является выделение дарбэпоэтина из культуральной жидкости с использованием различных методов очистки белков.

Процесс выделения состоял из нескольких этапов:

концентрирование и диафильтрация культуральной жидкости на мембранах, анионообменная хроматография, катионообменная хроматография, концентрирование конечного продукта, гель-фильтрация. На всех этапах и, в особенности, на этапах концентрирования культуральной жидкости и анионообменной хроматографии, сопровождающейся потерями слабо сиалированных форм дарбэпоэтина, проводили измерение концентрации целевого белка методом ОФ ВЭЖХ.

Эффективность выделения целевого продукта из смеси характеризуется показателем выхода продукта на конечной стадии. В таблице 16 приведены полученные концентрации дарбэпоэтина для трех серий культуральной жидкости и элюатов после первой стадии анионобменной хроматографии.

–  –  –

Как видно из приведенных данных, выход целевого белка после первой стадии анионообменной хроматографии составлял для разных серий культуральной жидкости от 7,4 до 27,5%. Предположительно такая разница по выходу целевого белка была связана с количеством целевых изоформ дарбэпоэтина в разных образцах культуральной жидкости.

Полученные элюаты и культуральные жидкости были проанализированы с помощью изоэлектрического фокусирования с последующим проведением иммуноблоттинга (Рисунок 34).

Рисунок 34. Электрофореграммы трех серий культуральной жидкости дарбэпоэтина и элюатов после выделения целевого белка, полученные в изоэлектрическом фокусировании На приведенных электрофореграммах видно, что образец культуральной жидкости дарбэпоэтина серии 340314 изначально не имел в своем составе наиболее сиалированных форм белка (Рисунок 34А), что и привело к низкому выходу по целевому белку при анионообменной хроматографии. Две других серии культуральной жидкости (Рисунок 34Б и 34В) содержали целевой белок со спектром изоформ, соответствующим контрольному белку дарбэпоэтина, и сопоставимые по выходу элюаты высокого качества.

Таким образом, применение аналитических методик изоэлектрофокусирования и ОФ ВЭЖХ позволяет не только осуществлять контроль эффективности процесса выделения на разных технологических стадиях, но и прогнозировать качество получаемой субстанции дарбэпоэтина.

2.2.6. Стандартизация конечного продукта

На этапе получения фармацевтической субстанции необходимо провести контроль полученной субстанции по основным параметрам.

К контролируемым параметрам относят концентрацию дарбэпоэтина в концентрированном растворе, устанавливаемую с помощью ОФ ВЭЖХ, которая должна составлять от 2 до 4 мг/мл, а также изоформенный состав белка и биологическую активность субстанции.

Для более точного анализа подлинности белка в фармацевтической субстанции по изоформенному составу было решено оптимизировать метод КЗЭ.

Изначально метод КЗЭ был воспроизведен для ЭПО по описанной в Европейской Фармакопее методике [32] (Рисунок 35А). Полученная электрофореграмма отвечала всем требованиям, описанным в Европейской Фармакопее данной методики для ЭПО.

Следующим шагом являлся перенос описанных условий проведения КЗФ для дарбэпоэтина. Однако полученные данные продемонстрировали непригодность таких условий для дарбэпоэтина, поскольку методика показала плохую разрешающую способность между пиками, что не позволяло провести обработку полученных данных (рисунок 35Б). Стоит отметить, что при изучении литературы не было установлено единых требований проведения анализа, поскольку различные авторы оптимизировали данный метод по-разному [90-95].

В связи с этим нами была проделана работа по подбору необходимых условий проведения разделения гликоформ дарбэпоэтина в субстанции, в ходе которой варьировались разные параметры проведения анализа такие как температура, состав буферного раствора, давление и т. д. В результате нам удалось установить, что наиболее значимое влияние на разделение изоформ в капилляре оказывает значение рН буферного раствора, которое было снижено на одну единицу (рН=4,5) и таким образом, нами был оптимизирован метод КЗЭ для дарбэпоэтина.

В результате была получена электрофореграмма образца сравнения, которая демонстрировала хорошее разрешение между пиками изоформ (Рисунок 35В).

Рисунок 35. Электрофореграммы, полученные с помощью КЗЭ для ЭПО в стандартных условиях (А), дарбэпоэтина в стандартных услових (Б) и дарбэпоэтина в оптимизированных условиях (В) Данный метод широко применим для белков эритропоэтинового ряда, так как он позволяет не только идентифицировать изоформы, но и установить относительное содержание каждой изоформы гликозилированного белка. Как уже говорилось выше, каждая изоформа ЭПО и дарбэпоэтина обладает собственной биологической активностью, в связи с чем и необходимо знать относительное содержание каждой изоформы, так как недостаток одной и избыток другой изоформы в субстанции может давать разную фармацевтическую эффективность.

В результате того, что дарбэпоэтин не имеет требований к стандарту качества, нами была разработана спецификация на количество и относительное содержание каждой гликоформы дарбэпоэтина в субстанции.

Для этого было отобрано три разных серии оригинального препарата Аранесп и каждая из серий была проанализирована в трех повторностях двумя разными методиками (изоэлектрическим фокусированием и КЗЭ) для наработки необходимого объема данных. В ходе проделанной работы удалось установить, что количество изоформ, определяемое изоэлектрическим фокусированием, составляет 4, а КЗЭ – 6. Относительное содержание этих изоформ определялось только с помощью методики КЗЭ. В таблице 17 представлены полученные данные по установленияю относительного содержания изоформ дарбэпоэтина с помощью КЗЭ в трех повторностях в трех различных сериях оригинального препарата.

–  –  –

Благодаря наработанной статистике, нами была создана спецификация по изоформенному составу субстанции дарбэпоэтина (Таблица 18). Поскольку определенных рекомендаций по созданию спецификации не существует, и каждая организация устанавливает спецификацию на свою продукцию самостоятельно, нами было решено рассчитывать диапазон относительного содержания изоформ с 2 по 5 как среднее значение из всего ряда полученных данных ±30%, а для 1 и 6 изоформ, в силу низких значений и широких вариаций от серии к серии, спецификация была расширена.

–  –  –

В итоге полученная субстанция дарбэпоэтина для идентификации форм белка была проанализирована двумя методами – изоэлектрическим фокусированием (Рисунок 36А) и КЗЭ (Рисунок 36Б).

Рисунок 36. Электрофореграммы субстанции дарбэпоэтина, полученные с помощью А) изоэлектрического фокусирования и Б) КЗЭ Данные, полученные с помощью двух методов, продемонстрировали наличие только целевых форм белка. С использованием КЗЭ удалось установить относительное содержание каждой изоформы дарбэпоэтина в полученной субстанции (Таблица 19).

–  –  –

Полученные результаты демонстрируют соответствие изоформенного состава полученной субстанции разработанной спецификации.

Далее субстанция была проанализирована для подтверждения ее биологической активности.

В литературе не приводится подробного описания методики установления биологической активности дарбэпоэтина, в связи с чем нами были рассмотрены методики, используемые для ЭПО. Для ЭПО в Европейской Фармакопеи описано несколько методов по определению его специфической активности [32]. Нами был выбран метод определения специфической активности на нормоцитемических мышах. Принцип метода заключается в измерении количества ретикулоцитов у мышей после ввода им дозы активного белка.

Подсчет количества ретикулоцитов проводился с помощью прибора ADVIA 120, обсчет полученных значений выполнялся с помощью программы PLA 2.0 методом регрессионного анализа.

В связи с тем, что данные литературы о величине биологической активности дарбэпоэтина крайне противоречивы, нами были проведены предварительные эксперименты по выбору диапазона измерения. В ходе проведения таких экспериментов были подобраны подходящие концентрации белка для ввода доз мышам, которые составляли 0,05, 0,1 и 0,2 мкг/мл. В ходе данного исследования было установлено, что 1 мг дарбэпоэтина в оригинальном препарате обладает специфической активностью около 1 000 000 (1 047 534 ±

115 229) МЕ. На рисунке 37 приведена зависимость количества ретикулоцитов от дозы дарбэпоэтина, введенной экспериментальным животным.

Рисунок 37. График зависимости количества ретикулоцитов от вводимой дозы субстанции дарбэпоэтина После того, как активность белка в оригинальном препарате была установлена, нами был проведен аналогичный тест для установления биологической активности для дарбэпоэтина в полученной субстанции. С помощью данного метода удалось определить, что 1 мг полученного белка дарбэпоэтина обладает активностью 1 074 010 ± 128 881 МЕ, что свидетельствует о сопоставимости удельных активностей полученной субстанции и оригинального препарата. Проведение экспериментов по определению биологической активности осуществлялось совместно с сотрудниками лаборатории иммунологии ФГУП ГосНИИгенетики.

Таким образом, были подобраны условия проведения оценки качества как готового продукта, так и полупродуктов на разных этапах технологического производства субстанции дарбэпоэтина, а также были разработаны спецификации для параметров качества активного белка для гарантии проведения высоко эффективного биотехнологического процесса и получения продукта надлежащего качества.

Разработанные и оптимизированные методики контроля качества субстанции дарбэпоэтина, а также спецификации на основные параметры гликозилированного белка были внесены в проект фармакопейной статьи предприятия и опытно-промышленный регламент.

Разработанные методики и спецификации оценки качества дарбэпоэтина представляют методологический подход для продуктов и полупродуктов на каждом этапе технологического процесса производства субстанции дарбэпоэтина.

2.2.7. Создание стандартного образца предприятия дарбэпоэтина

В соответствии с ГОСТ 8.315 «Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов» [96], была проведена разработка стандартного образца предприятия дарбэпоэтина для его дальнейшего применения в ходе биотехнологического процесса производства субстанции дарбэпоэтина. С этой целью серию полученной субстанции оценили по перечню нормируемых показателей, включенных в фармакопейную статью предприятия, а также дополнительных методов, обосновывающих пригодность ее в качестве стандарта предприятия.

Дополнительно была подтверждена подлинность дарбэпоэтина относительно образца сравнения – коммерческого препарата Аранесп методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI). Средняя молекулярная масса дарбэпоэтина (без учета гетерогенности белка) в образце сравнения и субстанции была идентична и составляла 39 ± 5кДа (Рисунок 38). Исследования проведены сотрудниками ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова.

Рисунок 38. Масс-спектр оригинального препарата Аранесп и стандартного образца предприятия дарбэпоэтина Вторым подтверждающим параметром была степень сиалирования белка.

Степень сиалирования белка в стандартном образце подтверждали путем количественного определения сиаловых кислот резорциновым методом. Данный анализ был проведен по стандартной методике, рекомендованной в Европейской Фармакопее для ЭПО [32]. Поскольку данный метод не чувствителен к структурным изменениям модифицированного ЭПО, то он не потребовал никаких работ по оптимизации. Однако нами была изменена спецификация для дарбэпоэтина с учетом большего количества сиаловых кислот в молекуле белка.

Минимальное количество молей сиаловых кислот, приходящихся на 1 моль дарбэпоэтина, было установлено из учета минимальной молекулярной массы коммерческого дарбэпоэтина (34 кДа) и составило 18 моль. Результаты, полученные в ходе проведения анализа, приведены в таблицах 20-22.

–  –  –

Полученные данные демонстрируют соответствие полученной субстанции дарбэпоэтина установленной спецификации, а также идентичность оригинальному препарату.

Таким образом, проведенные эксперименты показали соответствие полученной субстанции дарбэпоэтина разработанной спецификации и оригинальному препарату, в результате чего данная субстанция дарбэпоэтина была аттестована в качестве стандартного образца предприятия.

В дальнейшем по аналогичной схеме было получено и аттестовано еще два стандартных образца предприятия, на которые были выписаны паспорта (Таблица 23). Изучение стабильности стандартных образцов показало, что в течение 12 месяцев хранения при температуре -20 °С все показатели качества соответствуют специфицированным требованиям.

–  –  –

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Дарбэпоэтин альфа – один из широко используемых рекомбинантных белков, применяемый в качестве эффективного средства при лечении анемий различного происхождения [12-15, 20, 28-31, 46, 48]. В настоящее время на фармацевтическом рынке представлены лишь зарубежные препараты рекомбинантного дарбэпоэтина, в связи с этим организация производства отечественного белка является приоритетной задачей.

Представленная работа была направлена на разработку процесса оценки качества дарбэпоэтина на всех этапах процесса производства субстанции дарбэпоэтина. Для достижения поставленной цели был осуществлен индивидуальный подход к данному белку, учитывающий особые физикохимические и биологические свойства белка, его сверхгликозилирование и повышенную биологическую активность. В результате были выбраны наиболее важные контролируемые параметры белка и способы их оценки на разных стадиях производственного процесса.

Поскольку объект исследования – дарбэпоэтин альфа – является сверхгликозилированным белком, что в свою очередь отражается в увеличенной биологической активности белка, именно эти факторы оказались определяющими при оценке качества продуктов и полупродуктов на разных производственных стадиях.

Для получения белка использовалась клеточная линия СНО, как хорошо изученная и наиболее широко применяемая в мире для производства гликозилированных рекомбинантных белков [97-99]. Для выделения целевого белка из культуральной жидкости был осуществлен подход включающий ряд биотехнологических методов, таких как ультрафильтрация, анионообменная хроматография, гель-фильтрация и т.д. [56, 57, 65]. Каждый этап технологического процесса производства связан с последующим. Для получения продукта надлежащего качества и снижения экономических затрат, в случае плохой эффективности процесса, необходимо проводить оценку качества полупродукта на каждом этапе технологическогоь процесса по наиболее важным свойствам белка.

Так как в нашем случае эффективность лекарственного средства зависит от активности белка, которая напрямую связана со степенью гликозилирования, то нами были разработаны подходы для идентификации изоформенного состава целевого белка еще на стадии культивирования клеток продуцента. Для идентификации гликоформ дарбэпоэтина использовались два метода анализа – изоэлектрическое фокусирование и КЗЭ. Однако в случае с культуральной жидкостью применение метода КЗЭ невозможно, поскольку концентрация целевого белка в смеси достаточно низкая, а также невозможно проводить идентификацию пиков изоформ дарбэпоэтина на фоне пиков неспецифических примесей с аналогичной подвижностью. В результате для полупродуктов дарбэпоэтина был оптимизирован метод изоэлектрического фокусирования с последующей окраской раствором Кумасси. Дальнейшие предвалидационные эксперименты показали, что данный метод не применим для образцов культуральной жидкости в связи с недостаточной чувствительностью на фоне неспецифических примесей. В этом случае было принято решение проводить стадию иммуноблоттинга с применением специфических антител к ЭПО после стадии изоэлектрического фокусирования. Проведенная валидация методики продемонстрировала пригодность методики для ее применения к образцам культуральной жидкости дарбэпоэтина.

На данном этапе также немаловажным параметром оценки качества проведения процесса культивирования являлась продуктивность. Для выбора оптимальных условий культивирования необходимо было разработать методику установления концентрации целевого белка в образцах культуральной жидкости.

Поскольку культуральная жидкость – это смесь большого количества различных компонентов (клетки, нецелевые белки, продукты жизнедеятельности клеток и т.д.), то перед нами стояла задача разработать такую количественную методику, которая позволила бы идентифицировать именно дарбэпоэтин на фоне балластных компонентов и определить его концентрацию в образце. Такой популярный и простой метод как спектрофотометрическое определение белка в нашем случае является неподходящим, поскольку данный метод применим исключительно к читым растворам белков. В свою очередь применимый в случаех сложных смесей метод ИФА также не мог быть применим, поскольку на данный момент не существует разработанных коммерческих систем для дарбэпоэтина. В связи с изложенным выше, нами был разработан новый подход к установлению количественного содержания дарбэпоэтина в культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии. Данный метод был разработан и валидирован в соответствии со всеми международными требованиями к валидации разработанной методики. Методика показала валидность применительно к образцам культуральной жидкости дарбэпоэтина. Однако было установлено, что данная методика является экономически невыгодной.

В связи с этим была разработана другая альтернативная методика количественного определения дарбэпоэтина в различных образцах на базе ОФ ВЭЖХ. В ходе разработки и валидации методики были установлены критические параметры методики и проведена ее валидация, которая подтвердила возможность ее применения для образцов дарбэпоэтина и получение результатов с необходимой точностью. При этом методика ОФ ВЭЖХ показала себя более точной и экономически выгодной в сравнении с аффинной хроматографией.

Таким образом, все образцы на стадии получения и культивирования клона продуцента оценивались по двум параметрам - продуктивность и изоформенный состав с помощью ОФ ВЭЖХ и изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом соответственно.

На этапе выделения целевого белка из культуральной жидкости с помощью ряда методов биотехнологической очистки была проведена оценка качества элюата дарбэпоэтина после первой стадии анионообменной хроматографии, так как именно на этой стадии происходит отщепление менее сиалированных форм белка. На данном этапе биотехнологического процесса производства также проводилась оценка качества дарбэпоэтина по параметрам - профиль гликозилирования и концентрация дарбэпоэтина. Оценка качества дарбэпоэтина осуществлялась с применением ранее разработанных методик – ОФ ВЭЖХ и изоэлектрического фокусирования.

На стадии получения субстанции дарбэпоэтина помимо профиля гликозилирования и концентрации осуществляли оценку биологической активности дарбэпоэтина.

Однако для более точной идентификации изоформ гликозилированного белка была проведена оптимизация КЗЭ для дарбэпоэтина. Для этого в качестве базовой методики была взята методика КЗЭ, описанная в Европейской Фармакопее для ЭПО. При этом было показано, что такие условия не подходят для разделения форм белка. В результате был проведен подбор параметров метода, в ходе которого было установлено, что наиболее критичным условием в данном случае является рН буферного раствора, которое было изменено на одну единицу. В результате данный метод позволил не только провести идентификацию изоформ дарбэпоэтина, но и рассчитать их относительное содержание. Для создания спецификации по количеству и относительному содержанию изоформ для данного белка была также проделана работа по наработке необходимой статистики.

Для установления биологической активности дарбэпоэтина был использован метод in vivo на нормоцитемических мышах, описанный в Европейской Фармакопее для ЭПО. Однако с учетом большей активности дарбэпоэтина относительно ЭПО предварительно были подобраны необходимые дозы вызывающие прямопропорциональный ретикулоцитарный ответ у лабораторных животных и установлена биологическая активность препарата сравнения.

Однако поскольку адекватная оценка качества любого аналита предполагает применение стандартного образца предприятия, то далее нами был разработан стандартный образец предприятия дарбэпоэтина, который был охарактеризован дополнительно такими методами как времяпролетная масс-спектрометрия и резорциновый метод (для установления степени сиалирования).

Таким образом, проведенные исследования позволили разработать методологический подход оценки качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса производства, а также разработать и провести стандартизацию трех серий стандартного образца предприятия.

Полученные результаты могут быть применены на производственной площадке ООО «Фармапарк» для получения лекарственного средства дарбэпоэтина надлежащего качества.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработанная методика ОФ ВЭЖХ, которая по своей специфичности, чувствительности (ПКО 0,25 мкг) и точности (RSD не превышает 2%) является универсальной для количественного определения дарбэпоэтина в различных смесях, в том числе и таких сложных как культуральная жидкость.

2. Применение изоэлектрического фокусирования на первых стадиях технологического процесса производства биофармацевтической субстанции (стадия отбора клона-продуцента, оценка качества культуральной жидкости) позволяет достоверно идентифицировать наличие целевых изоформ по значению их pI в образцах на фоне примесных компонентов в концентрациях, многократно превышающих концентрацию дарбэпоэтина, что способствует отбору высокопродуктивной линии продуцента дарбэпоэтина.

3. Установленные критерии качества для каждого этапа производственного процесса получения биомедицинского препарата на основе генно-инженерного белка дарбэпоэтина представляют собой концентрацию белка, наличие целевых форм и биологическую активность дарбэпоэтина.

4. Валидация разработанных методик по основным аналитическим характеристикам показала, что методика определения подлинности белка с помощью изоэлектрического фокусирования является специфичной с пределм обнаружения 0,20 мкг, а методика количественного определения дарбэпоэтина является специфичной, линейной в диапазоне нагрузки белка на колонку 2 – 3 мкг, прецизионной (т.к. RSD для повторяемости и промежуточной прецизионности составляет менее 2%), правильной (степень извлечения лежит в диапазоне 95-105%), устойчивой к малым внешним изменениям, при этом предел количественного определения равен 0,25 мкг.

5. Разработанный стандартный образец предприятия был аттестован по специфицированным показателям качества с применением как основных методов

– изоэлектрического фокусирования, КЗЭ, установления биологической активности in vivo, так и с помощью дополнительных методов – времяпролетной масс-спектрометрии, который подтвердил молекулярнуюмассу белка – 39±5 кДа, а также с помощью резорцинового метода было установлено, что на 1 моль дарбэпоэтина приходится 21 моль сиаловых кислот, что соответствует разработанной спецификации.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«Пояснительная записка Изменение структуры школьного образования выделение базовой девятилетней обязательной общей ступени повлекло за собой перестройку школьной биологии. Базовое биологическое образование должно обеспечить выпускникам высокую биологическую, преж...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель министра В.В. Колбанов 17 февраля 2003 г. Регистрационный № 29–0203 МЕТОД КОМПЛЕКСНОЙ ОЦЕНКИ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ Инструкция по при...»

«Департамент образования города Москвы Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования города Москвы "Московский городской педагогический университет" Институт естественных наук Географический факультет ПРОГРАММА ВСТУПИТЕЛЬНОГО ЭКЗАМЕНА В АСПИРАНТУРУ ПО СПЕЦИАЛЬНОСТИ 25.00.36 ГЕОЭКОЛОГ...»

«отзыв официального оппонента Зинченко Валерия Петровича на диссертационную работу Кировой Юлии Игоревны на тему: "Регуляторная роль сукцинатзависимых сигнальных систем (H IF -la и GPR91...»

«волчок держался по кромке зарослей рогоза, где самостоятельно охотился на пресноводных креветок. Следует указать, что с 1958 по 1997 год орнитофауна окрестностей озера находилась под постоянным вниманием орнитолога Юрия Николаевича Назарова. Китайский волчок в тот п...»

«ВОСТОЧНОЕВРОПЕЙСКИЙ БОТАНИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК. 2007. № 2. С.181-227. УДК 581.9 (471.56) РАСТИТЕЛЬНОСТЬ КАМЕНИСТОЙ СТЕПИ ЖИГУЛЕВСКИХ ГОР СИСТЕМАТИЧЕСКИЙ ПЕРЕЧЕНЬ ВИДОВ ФЛОРЫ Л.М. Черепнин * ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРА Начиная с этого...»

«КАРЕВ Вадим Евгеньевич КЛИНИЧЕСКИЕ И ИММУНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА ХРОНИЧЕСКОЙ HBVИ HCV-ИНФЕКЦИИ 14.01.09 – инфекционные болезни 14.03.02 – патологическая анатомия Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты – з.д.н. РФ, академик РАН, д.м.н., профессор Ю.В. Лобзин...»

«БИОЛОГИЯ БИОЛОГИЯ УДК 502.1(470.53) ООПТ КРАСНОВИШЕРСКОГО РАЙОНА: ИСТОРИЯ, СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ© П.Н. Бахарев, С.И. Ильиных ФГБУ "Государственный природный заповедник "Вишерский", г. Красновишерск PROTECTED AREAS OF KRASNOVISHERSKY DISTRICT: HISTORY, CURRENT STATE AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT P.N. Bakhar...»

«ФИЛОСОФСКИЕ НАУКИ УДК 172 Бородин Евгений Андреевич Borodin Evgeny Andreyevich аспирант кафедры философии PhD student, Philosophy Department, Ивановского государственного университета Ivanovo State U...»

«УДК 616.008+615.861 ИЗУЧЕНИЕ ГЛАВЫ "НЕРВНАЯ СИСТЕМА" ПО БИОЛОГИИ В ШКОЛЕ А.М. Бабашев, кандидат биологических наук, профессор Казахский национальный педагогический университет имени Абая (Алматы), Казахстан Аннотация. Рассматривается проблема изучения главы нервной...»

«Остроумов С.А. Концепции экологии экосистема, биогеоценоз, границы экосистем: поиск новых определений // Вестник МГУ. Серия 16. Биология. 2003. № 3. С.43-50. Табл. Рез. на англ. яз. Библиогр. 44 назв. [Нов. трактовка, нов. варианты определений. Перечисляются и обосновываются отличия новых определений от ранее существовавших. П...»

«2012.03.038 природой изучаемых феноменов. Исследователям разных специальностей есть что сказать не только друг другу, но и выразить коллективное мнение о социальных и культурных проблемах всему миру политмейкеров (с. 401). Для Эллена, по его...»

«Научный журнал НИУ ИТМО. Серия "Экономика и экологический менеджмент" № 2, 2014 УДК 613.846 Некоторые психологические и правовые аспекты профилактики табакокурения Лопатина В.Ф. vf.lopatina@gmail.com Осипов О.А. oosip@mail....»

«ISSN 0869-4362 Русский орнитологический журнал 2015, Том 24, Экспресс-выпуск 1147: 1859-1866 О гнездовании водяных птиц на мелководьях у заказника "Северное побережье Невской губы" Ю.М.Михайлов, Э.М.Зайнагутдино...»

«593 Инженерно-экологический факультет Вероятность получения электротравмы на данных станках резки металла крайне мала и возрастает в основном при неправильной установке и монтаже оборудования. Для обеспечения безопасности на ЗАО "ТОМЗЭЛ" рекомендуется прокладывать силовые кабели в специальных промышленных кабель-каналах, ко...»

«Вычислительные технологии Том 3, № 5, 1998 О РАЗРАБОТКЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ГИС “ПРИРОДНЫЕ РЕСУРСЫ АЛТАЙСКОГО КРАЯ” Ю. И. Винокуров, С. Л. Широкова, О. В. Ловцкая, К. В. Воробьев, С. Г. Яковченко Институт водных и экологических проблем СО РАН Барнаул, Россия The work is devoted to the develop...»

«НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ НОВОСТИ НАУКИ КАЗАХСТАНА НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ Национальный центр научно-технической информации НОВОСТИ НАУКИ КАЗАХСТАНА НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ 1 ( 127) № Алматы 2016 Научно-технический журнал "Новости науки Казахстана" публи­ кует статьи по следующим направлениям исс...»

«Моросанова Мария Александровна Механизмы повреждения клеток эпителия почечных канальцев при моделировании пиелонефрита in vitro 03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в НИИ...»

«ВЕСТНИК КАЗНМУ №3-2015 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Б.И. Давыдов, Б.Н. Ушаков. Яденый и радиационный риск: человек, общество и окружающая среда. Под ред.Ушакова Б.И. С. 234. Гигиенические нормативы "Санитарно-эпидемиологические тре...»

«Федеральное агентство по образованию Федеральное государственное образовательное учреждение 1. Цели и задачи изучения дисциплины 1.1 Цель преподавания дисциплины Целью изучения дисциплины "Основы природопользования" являетс...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2014. – Т. 23, № 2. – С. 191-200. 595.1: 597/599 ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ И ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ГЕЛЬМИНТОВ ПОЗВОНОЧНЫХ СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ © 2014 А.А. Кириллов, Н.Ю. Кириллова, И. В. Чихляев Институт экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти (Россия)...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Утверждаю: Ректор _ А.Д. Гуляков "" _ 201 г. Номер внутривузовской регистрации ОСНОВНАЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ПРОГРАММА ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ Направление подготовки...»

«УДК 597.554.3 НИКИТИН Виталий Дмитриевич ГОЛЬЯНЫ ОСТРОВА САХАЛИН (систематика, распространение, экология) Специальность 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2010 Работа выполнена в Сахалинском государственном университете (СахГУ) и Сахалинском научно-исследовательском институте рыбного...»

«В. В. Куропаткин V. Kuropatkin ОБЗОР РОДА TRAUNSTEINERA RCHB. (ORCHIDACEAE) TAXONOMIC REVIEW OF THE GENUS ТRAUNSTEINERA RCHB. (ОRCHIDACEAE) Ботанический институт им. В. Л. Комарова Р...»








 
2017 www.net.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.